高强度聚焦超声对人乳腺癌细胞的生长抑制作用及机理研究

目的 研究高强度聚焦超声 (HIFU)对人肿瘤细胞的杀伤作用 ,并探索其作用机理。方法 用不同强度HIFU处理人乳腺癌细胞 MCF- 7,用台盼蓝排斥法染色、细胞增殖试验 (MTT法 )、克隆形成实验研究 HIFU对癌细胞的杀伤和生长抑制作用 ;用流式细胞术检测 HIFU对癌细胞周期、凋亡及相关基因表达的影响。结果 用 HIFU处理后 ,癌细胞死亡率升高 ,增殖活性降低 (P<0 .0 5 ) ,克隆形成下降 (P<0 .0 0 1) ,G0 /G1 期细胞数增加 (P<0 .0 5 ) ,S期细胞数减少 (P<0 .0 1) ,凋亡指数升高 (P<0 .0 1) ,热休克蛋白表达升高 (P<0 .0 5 ) ,P5 3、BCL- 2、FAS表达阳性细胞数与对照组比 ,无显著性差异 (P>0 .0 5 )。结论 HIFU对人乳腺癌细胞有明显的杀伤及抑制生长和克隆形成作用 ,其机理与抑制 DNA合成有关 ;HIFU具有诱导癌细胞凋亡作用 ,可能与 P5 3、BCL- 2、FAS的介导和调控无关。

体外诱导成熟树突状细胞的研究

目的 :探讨在体外从干细胞中诱导出成熟DC的适宜环境。方法 :分别将人胎肝、骨髓和脾细胞以及小鼠骨髓和脾细胞在体外用GM CSF和TNF α诱导 ,观察了第 3、5、7天DC的收获情况。进一步用S P免疫细胞化学染色检测了mBmDC和fLDC有关分子表达。结果 :在体外通过GM CSF和TNF α的作用 ,小鼠骨髓、人胎肝、骨髓细胞呈典型的毛刺状胞浆突起 ,第5天的收获率分别为 :39 5 %、6 7 2 %、12 9% ,而基本不能从脾细胞中诱导出成熟DC ,获得的DC能与MAbCD80、MAbCD40呈强阳性反应。结论 :在GM CSF和TNF α的共同作用下 ,能在体外从人胎肝、骨髓和小鼠骨髓干细胞中获得成熟DC ,其DC能表达高水平的B7 1和CD40分子 ,这为大量获取DC提供了一种简便可行的手段 ,为研究DC的生物学特征及其抗原提呈功能提供了丰富的材料 。

肺癌DC融合细胞诱导的抗肿瘤免疫应答

目的研究肺癌 DC融合细胞 FL D- A11体内外诱导免疫应答的能力。方法用 MTT法测定 FL D- A11细胞诱导淋巴细胞增殖的能力 ;EL ISA法检测其诱导淋巴细胞分泌 IL- 2的水平 ;L DH释放法测定 FL D- A11细胞免疫后小鼠脾淋巴细胞的特异性 CTL 活性。结果 FL D- A11细胞能有效刺激淋巴细胞的增殖反应 ( SC∶ RC=1∶ 5 0时 ,SI=2 .3 8) ,诱导淋巴细胞分泌 IL- 2。 FL D- A11细胞免疫后 ,小鼠的胸腺和脾脏重量均高于对照组 ( P<0 .0 5 ) ,脾淋巴细胞对 L ewis肺癌细胞的杀伤活性显著高于对照组。结论 FL D- A11细胞具有诱导初次抗肿瘤免疫应答的能力 ,不仅能在体外诱导淋巴细胞的增殖和 IL- 2的分泌 ,而且体内免疫接种也能引起小鼠免疫器官的增生反应 ,产生针对 L ewis肺癌的特异性 CTL 杀伤作用。

负载肺癌抗原DC疫苗抗肿瘤免疫实验

目的探讨负载人肺癌细胞株A549冻融抗原DC疫苗体外抗肿瘤免疫效应。方法自脐血分离单核细胞,经rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α诱导树突状细胞(DC),负载人肺癌细胞株A549冻融抗原、LPS诱导成熟,利用免疫磁珠分选获得功能性肺癌DC疫苗(UbDC/AgL),ELISA测定UbDC/AgL培养上清中细胞因子浓度、LDH法测定特异性细胞杀伤(CTL)活性及MTT法检测自身混合淋巴细胞反应(AMLR)。结果UbDC/AgL细胞组IL-1、IL-12、IL-6和IFN-β含量明显高于UbDC/Ag和UbDC组(P<0.01);UbDC/AgL疫苗细胞能有效诱导肿瘤特异性CTL活性,对A549细胞有特异性杀伤作用(P<0.01),并能有效促进淋巴细胞增殖。结论负载肿瘤冻融抗原DC疫苗,能有效激活T淋巴细胞进而诱导肿瘤特异性杀伤效应。

HGPRT缺陷型Lewis肺癌细胞株的筛选及其生物学特征

目的 为细胞融合等实验提供次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)缺陷细胞株。方法 用 8 氮杂鸟嘌呤 ( 8 AG)对Lewis肺癌细胞株L3 8进行长期渐进式给药 ,从中克隆筛选出HGPRT缺陷细胞株 ,并观察其体内成瘤和肺转移特性。结果 经过 1年的筛选鉴定 ,获得了在 2 0mg/L 8 AG和 16 40培养液中能长期稳定生长 ,在HAT选择性培养基中不能形成克隆的AL990 1细胞株。AL990 1和L3 8的染色体众数分别为5 8和 6 2 ,在C5 7BL/ 6小鼠体内成瘤率均为 10 0 % ( 10 / 10 ) ,肺转移率分别为 30 % ( 3/ 10 )和 70 % ( 7/ 10 )。结论 HGPRT缺陷型AL990 1细胞株基本保持了L3 8细胞的生物学特征 ,可作为制备Lewis肺癌DC融合疫苗的亲本抗原细胞。

Lewis肺癌耐药细胞的诱导及其耐药性的初步研究

目的 建立肺癌耐药动物模型 ,诱导耐ADM的Lewis肺癌细胞株 ,并鉴定其生长特性、细胞内药物的释放特性及耐药谱。方法 用渐进式给药法诱导建立耐ADM的Lewis肺癌细胞株 ,绘制生长曲线 ,计算倍增时间 ;用IPP图象分析系统观察比较耐药细胞及其亲本细胞内ADM和Rh B的荧光光密度 ;荧光分光光度计法测定细胞内ADM含量并绘制ADM释放曲线 ;MTT法测定细胞的IC5 0 ,计算耐药指数。结果 经 14个月的诱导培养获得了能在 0 .4μg mlADM中稳定生长的Lewis肺癌细胞株———L3 8/ADM ,其在动物体内的成瘤率为 10 /10 ;在 0 .15mg/lADM和普通 164 0培养基中的倍增时间分别为 2 2 .0h和 2 1.8h ;在 4mg/lADM和Rh B中培养后 ,耐药细胞及其亲本细胞内的荧光光密度比分别为 2 .82∶1和 2 .65∶1,耐药细胞内的ADM含量仅为其亲本细胞的 64 .7% ,但其药物释放速度无明显差异。L3 8/ADM细胞除对ADM耐药外 ,对DNR、VCR、MIT和CDDP也有不同程度的耐药性。结论 L3 8/ADM是一株典型的MDR细胞株 ,其耐药作用可能是由于胞膜的药物渗透受阻所至。

SOCS1对LIGHT诱导的骨髓来源DC分化成熟的影响

为探讨SOCS1是否参与LIGHT诱导的骨髓来源树突状细胞(BmDC)分化成熟,及其在此过程中的作用。RT-PCR检测受LIGHT刺激后小鼠BmDC、小鼠脾脏来源树突状细胞(sDC)中SOCS1mRNA水平及BmDCSOCS1mRNA水平的时间动力学;利用反义核苷酸技术抑制SOCS1的表达,通过流式细胞术(FACS)测定BmDC表面分子CD40、CD86的表达水平来分析阻断SOCS1对LIGHT诱导的BmDC分化成熟的影响。结果显示LIGHT刺激后,BmDCSOCS1mRNA水平迅速增高,并呈峰度变化,在4h时达到高峰;正常无SOCS1mRNA表达的sDC在加LIGHT后可检测到SOCS1mRNA;所设计SOCS1反义寡核苷酸能特异阻断SOCS1mRNA;在LIGHT作用下,SOCS1抑制组较非抑制组的CD40表达明显升高(P<0.05),CD86呈中度升高(P<0.05)。LIGHT在刺激BmDC分化成熟过程中上调了SOCS1的表达,阻断SOCS1使BmDC对LIGHT的反应更敏感,从而使BmDC成熟度更高;SOCS1对LIGHT诱导的BmDC分化成熟有负反馈调节作用。

小鼠肺癌细胞与树突状细胞融合的研究

目的使肺癌细胞表达共刺激分子,探讨其作为疫苗的可能性。方法小鼠骨髓细胞在体外经GM-CSF和TNF-α诱导,使之成为成熟树突状细胞(BmDC)。将其与小鼠Lewis肺癌细胞系AL9901融合,并以S-P免疫细胞化学染色法检测融合细胞和BmDC上有关分子的表达。结果通过GM-CSF和TNF-α诱导获得BmDC,以诱导5d时收获为佳。获得的BmDC能高表达B7-1和CD40分子,与肺癌细胞融合后,获得的融合细胞仍能高表达B7-1和CD40分子。结论通过将小鼠肺癌细胞与树突状细胞融合,使肺癌细胞获得了BmDC表达的B7-1和CD40分子,从而提高了其免疫原性,为制备肺癌疫苗奠定了基础。

人鼻咽癌癌基因及其产物的研究

作者应用外源性DNA转染技术,以人鼻咽癌组DNA,在体外对NIH/3T3细胞进行转染实验。结果观察到在第1、2轮转染中,均获得明显转化灶。并以人Alu顺序为探针,经分子杂交证明1、2轮转化细胞DNA中含有人顺序。以转化细胞注入裸鼠皮下,能诱发形成纤维肉瘤。本实验表明人鼻咽癌DNA中存在具有转化活性的转化基因(癌基因),并已转移至细胞内,发生了明显的恶性转化。作者应用免疫组化技术,观察了Ha-ras基因产物p21蛋白质在人鼻咽癌中的表达。其结果表明,p21在人鼻咽癌中具有阳性表达,其阳性率为90.4％。

胃肠道恶性肿瘤患者治疗前后血清CEA水平的动态分析

目的 :探讨治疗前后不同时期胃肠道恶性肿瘤患者血清CEA水平的变化规律及临床意义。方法 :采用CEA单克隆抗体酶联免疫检测试剂盒 ,检测患者血清CEA水平 ,用统计学方法对检测结果进行比较分析。结果 :胃肠道恶性肿瘤患者手术前CEA水平显著高于健康人(P<0.005) ,手术后CEA普遍降低至较低水平。当患者再进行化疗时 ,化疗结束后60天内81.8%(18/22)的患者血清CEA有升高现象 ;61天～180天再次复查时 ,其中13例患者CEA水平又降至化疗前的水平。结论 :手术治疗可降低胃肠道恶性肿瘤患者的血清CEA水平 ;化学药物治疗可使患者出现短暂的(60天内)、可恢复的血清CEA升高过程 ,在此期间内CEA值尚不能作为肿瘤复发或转移的指征。动态分析患者CEA水平对肿瘤诊断和疗效评价有重要意义 ,化疗后患者CEA水平升高的机制待进一步研究。

肝脏可溶性复合物不同剂量、不同途径移植对肿瘤细胞增殖抑制的体内外实验

目的:肝脏可溶性复合物具有保护肝脏、刺激肝组织再生等生物学活性,观察天然物质肝脏可溶性复合物对肿瘤细胞生长增殖的抑制作用。方法:实验于2006-05/2007-02在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室实验肿瘤研究室完成。①分离人胚胎、成年及新生小鼠肝脏组织,生理盐水清洗、剪碎、筛网过滤,用生理盐水制备混悬液,3000r/min离心,收集上清,制备肝脏可溶性复合物。②体外实验:用上述不同来源的肝脏可溶性复合物体外处理肿瘤细胞,四甲基偶氮唑盐比色法测定其对乳腺癌细胞EMT6增殖的影响。③体内实验:观察成年鼠肝脏可溶物质对乳腺癌细胞EMT6体内生长的抑制作用及其对荷瘤鼠生存状况的影响,包括不同给药剂量及不同给药途径两个实验,给药途径包括在接种肿瘤细胞部位的对侧腋下、同侧腋下、腹腔注射及灌胃等。结果:①体外实验显示不同来源的肝脏可溶性复合物能明显抑制肿瘤细胞EMT6增殖率,肿瘤增殖抑制率均显著高于血清白蛋白处理组(P<0.05),并呈剂量依赖性。②成年鼠肝脏可溶物质8mg/L组抑瘤率高于2,4mg/L组(P<0.05),未观察到明显毒副效应。③比较不同给药途径,成年鼠肝脏可溶物质同侧注射组的抑瘤率较其他3组的抑瘤率高(P<0.05),各成年鼠肝脏可溶物质给予组的体质量增长率比相应生理盐水对照组高(P<0.05)。④与相应生理盐水对照组比较,在同侧腋下注射成年鼠肝脏可溶物质的小鼠生存期明显延长(P<0.05)。结论:肝脏可溶性复合物具有抑制肿瘤细胞生长的作用,并且呈一定的剂量依赖性。不同的给药途径中,在接种肿瘤细胞部位的同侧腋下给药抑瘤效果最好。

人宫颈癌DNA与HPV16型核酸分子杂交的研究

本文以人乳头状瘤病毒(HPV)16型-PBR_(322)重组质粒,对大肠杆菌HB101进行转化实验。经筛选、扩增、酶切、电泳鉴定。获得满意的电泳图谱及kb值,HPV-16Bam HI DNA为7.2kb,其260/280O.D比值为1.9-2。纯度合乎要求,可用以制备探针。以HPV-16DNA7.2kb片段为探针,应用^(32)P(α)-dATP标记进行了点杂交及Southern印迹杂交实验。结果表明38例宫颈癌组织DNA,其点杂交阳性率为76.3％,Southern杂交阳性率为65.7％。点杂交与Southern杂交结果基本符合。上述结果说明了在人宫颈癌组织中,存在着HPV-16相关的基因组,Southern杂交表明其以整合形式存在。说明宫颈癌的发病可能与HPV-16型的感染有密切关系。从分子水平进一步探讨了宫颈癌的病毒病因。

正常C_(57)鼠肝、H_(22)肝癌及S_(180)肉瘤LD_5的纯化及其性质研究

以正常C_(57)鼠肝、H_(22)肝癌及S_(180)肉瘤,经一系列离子交换层析及亲和层析,获得了高纯度的LD_5。对三种组织的LD_5的部分酶动力学参数、亚基分子量及等电点的比较研究表明:H_(22)肝癌及S_(180)肉瘤的LD_5对丙酮酸的K_m值较正常C_(57)鼠肝LD_5显著降低,而LD_5含量(mg/g组织)、LD_5占LDH总活性的百分率均较正常高;三种组织的兔抗鼠LD_5间呈现交叉免疫反应。本研究所获的三种兔抗鼠LD_5抗体为进一步研究癌变时LD_5活性升高的分子机理奠定了基础。

体外培养人成纤维细胞转化生长因子-β_1自分泌规律的研究

目的 探讨体外培养人成纤维细胞转化生长因子 -β1 (TGF-β1 )的自分泌规律。方法 应用健康人包皮环切术所得包皮 ,通过体外成纤维细胞传代培养共 12代 ,运用 EL ISA法 ,分别检测不同代次成纤维细胞 TGF-β1 浓度 ,并测定第 6代成纤维细胞在不同时间培养上清液中 TGF-β1 的浓度。结果 自第 3代开始 ,成纤维细胞培养上清液可检测到 TGF-β1 ,并逐渐升高 ,至第 6代达分泌高峰 (45 0 ng/ L ) ,第 11、12代不能测到 ;而第 6代成纤维细胞 ,培养上清液中 TGF-β1 含量以第 5天的检测值最高 (6 80 ng/ L ) ,是第 1天检测值 (2 80 ng/ L )的 2 .5倍。结论 成纤维细胞 TGF-β1 自分泌能力 ,是由弱到强再逐渐减弱的过程 。

肿瘤转移抑制基因nm23H_1产物在人鼻咽癌中表达的研究

采用ＳＰ免疫组化技术，以ＮＤＰＫ／ｎｍ２３Ｈ１特异的单克隆抗体为探针，对人鼻咽癌中ｎｍ２３Ｈ１的表达及其与颈淋巴结转移的关系进行了研究。结果：３１例鼻咽癌中ｎｍ２３Ｈ１基因产物表达的阳性率为４１．９％（１３／３１）。其中无转移组的阳性率为５２．３％（１１／２１），有转移组的阳性率为２０％（２／１０），两组间具有显著性差异（Ｐ＜０．０１），而在转移的颈淋巴结组织中ｎｍ２３Ｈ１产物表达极微或无表达，其阳性率为０，与无转移组比较有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。上述结果说明，肿瘤转移抑制基因ｎｍ２３Ｈ１产物的表达，在无转移组呈高表达，在有转移组及淋巴结转移组中呈低表达，其表达与转移呈负相关。

CpG ODN加强树突状细胞疫苗抗Lewis肺癌的研究

目的 探讨CpGODN对树突状细胞 (DC)疫苗抗肿瘤作用的影响。方法 应用ODN182 6作为DC的成熟刺激信号 ,体外控制DC充分成熟 ,以混合或融合的方式将肿瘤抗原负载于DC制备DC疫苗。以特异性杀伤细胞活性和淋巴细胞增殖反应测定疫苗的体外免疫活性 ,并将疫苗经小鼠腹腔注射 ,观察治疗和预防实验肿瘤的生长情况。结果 经ODN 182 6刺激后的DC细胞形态呈成熟状态 ,流式细胞仪分析检测刺激前后DC细胞表面分子CD4 0的表达分别为 11和 2 4 (MFI) ,CD86的表达分别为 33和 75 (MFI) ,刺激后的DC培养上清中IL 12的分泌水平为刺激前的 10倍。刺激后DC融合疫苗组CTL活性、T淋巴细胞增殖活性及体内Lewis肺癌移植瘤的抑瘤率均明显高于未刺激的DC融合组 (P <0 .0 5 )。结论 CpGODN能通过诱导DC成熟 ,增强DC疫苗的抗肿瘤作用 ,有效诱导机体产生特异的抗肿瘤反应。未成熟的DC可通过与肿瘤细胞混合的方式 ,获得较好的抗原捕获效果 ,产生一定的抗肿瘤效应 ,而对于刺激成熟的DC则需通过融合手段负载抗原 ,达到有效的抗肿瘤活性。