冻干甲型肝炎减毒活疫苗与免疫规划疫苗同时接种疑似预防接种异常反应监测数据分析

目的分析国家免疫规划(NIP)主要使用的冻干甲型肝炎减毒活疫苗产品(HepA-L)与其他NIP疫苗同时接种后疑似预防接种异常反应(AEFI)的发生特征,初步评价其安全性,为日常同时接种提供参考。方法采用描述流行病学方法对中国免疫规划信息管理系统收集的2013~2018年Hep A-L与其他NIP疫苗同时接种AEFI个案数据进行分析。结果 2013~2018年,HepA-L与其他NIP疫苗同时接种AEFI共报告482例,主要人群为1~2岁儿童,男童多于女童。同时接种NIP疫苗共有10种,AEFI报告数排前3位为麻腮风联合减毒活疫苗、无细胞百白破联合疫苗、流行性乙型脑炎减毒活疫苗。Hep A-L分别与3类疫苗同时接种后,一般反应占86.11%~88.69%、异常反应占10.24%~13.89%。同时接种98.21%AEFI发生在0~3 d,各症状转归情况良好,无死亡病例。经与各NIP疫苗单独接种国家AEFI监测数据对比,同时接种未发生新的异常反应,未增加接种风险。结论在受种者身体健康、无禁忌症的情况下,HepA-L可与适龄段其他NIP疫苗同时接种,但需关注罕见严重异常反应的发生。

探究建筑工程造价预结算审核工作的要点

在社会经济迅猛发展的背景下,我国建筑工程规模在进一步扩大,使得建筑行业得到了前所未有的发展和突破。与此同时,在建筑工程建设的过程中,最为核心的一项工作内容,就是预结算审核工作,可以最大化的保证造价效益。但是预结算审核工作涵盖内容较多,涉及范围非常广,需要明确各项要点内容,才能实现科学实施,达到预期的应用效果。

EV-A71和CV-A16感染正常人呼吸道上皮细胞诱导差异性IFN-I产生通路相关基因表达的研究

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种全球性的传染病,其主要病原体为肠道病毒A组71型(Enterovirus group A 71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(cosackievirus A 16,CV-A16)。EV-A71感染易引发重症病例及死亡病例,而CV-A16感染所致的症状普遍较轻,且CV-A16容易引发重复感染,但目前其中的机理仍不清楚。本研究比较了EV-A71与CV-A16感染正常人呼吸道上皮细胞16HBE后I型干扰素(Type I interferon,IFN-Ι)产生相关基因的改变。结果发现EV-A71感染后TLR3、TLR7、RIG-I、MDA5、MAVS、MyD88、IRF3、IRF7、IFNα和IFNβ的基因表达量均发生了显著性地上调,而在CV-A16感染后仅MDA5显著性上调;TLR3和IRF3的基因表达水平显著性地下降,而其它基因表达水平均无显著性地变化。此外,病毒滴度和病毒拷贝数的检测结果显示,CV-A16在16HBE上的复制效率明显高于EV-A71。上述结果提示我们EV-A71和CV-A16感染16HBE对其IFN-I产生相关基因表达的影响完全不一样,且CV-A16更容易感染人呼吸道上皮细胞。本研究为EV-A71和CV-A16引起的临床症状差异的机理研究以及CV-A16重复感染的机理研究提供了线索。

细胞自噬对甲型流感病毒H1 N1感染A549细胞过程中病毒复制及Ⅰ型干扰素表达的影响

目的 通过研究细胞自噬在甲型流感病毒H1 N1感染细胞过程中对病毒复制及Ⅰ型干扰素表达的影响,为进一步阐明流感病毒感染机制提供实验资料.方法 利用自噬抑制剂三甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）抑制细胞自噬,流式细胞术检测3-MA对细胞凋亡的影响,激光共聚焦显微镜观察H1N1感染A549细胞后的自噬现象,利用real-time PCR检测自噬被抑制前后病毒拷贝数的变化以及Ⅰ型干扰素（typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ）产生通路各基因mRNA表达量的变化.分析细胞自噬对病毒复制及干扰素表达的影响.结果 当H1N1感染A549细胞后可诱导细胞产生不完全自噬,导致自噬体积累.当自噬被3-MA抑制后,TLR3-TLR7-MyD88-IRF7-IFN-α/β信号通路各基因mRNA表达量上调,与此同时病毒拷贝数及血凝滴度下调.结论 H1N1可能通过诱导不完全自噬逃逸了机体的抗病毒固有免疫应答,促进了自身复制和存活.

EV68中国分离株VP1基因高变区的特征分析

目的了解肠道病毒68（EV68）中国流行株VP1基因序列的特征。方法通过Clustal W法与多个国家EV68的VP1核酸序列进行比对，邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，与标准株Fermon相比，对该段区域编码的氨基酸序列进行分析。结果截至2015年底，中国已经分离出80株EV68。在进化上，突变主要发生在BC和DE环中，中国分离株VP1突变位置在83、89、91、94、96、97、98、102、109、139、141、142、143、144、147。并且大多数分离株VP1编码的氨基酸序列在140位置发生缺失。由进化树可以得出位于B、C进化分支的中国分离株分别为53株和21株。结论与标准株Fermon相比，发现在BC-loop和DE-loop发生了很大变化，然而BC-loop和DE-loop这两个区域与病毒的抗原性和毒力有关。中国EV68分离株位于B和C分支上。

柯萨奇病毒A组16型cDNA感染性克隆的构建

目的构建柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)c DNA感染性克隆。方法提取CA16基因组RNA,经RT-PCR得到基因组全长c DNA,插入至TOPO-XL-PCR载体,获得CA16全长c DNA克隆。采用T7聚合酶系统将线性基因组c DNA体外转录出病毒基因组RNA,纯化后转染Vero细胞,获得拯救病毒。通过RT-PCR、基因测序及免疫荧光法对拯救病毒进行鉴定,并对拯救病毒与母本病毒的增殖特性进行比较。结果病毒基因组RNA转染Vero细胞后48 h,可见典型的肠道病毒致细胞病变。拯救病毒经RT-PCR、基因测序和免疫荧光鉴定为CA16,且与母本野生型病毒增殖特性基本一致。结论成功构建了具有感染性的CA16全长c DNA克隆,为研究CA16基因功能和研发CA16新型疫苗奠定了基础。

肠道病毒-D68型流行株3C和3D蛋白结构域序列和结构特征比较分析

目的 利用生物信息学的方法,探究不同亚型肠道病毒-D68型（EV-D68）的3C和3D非结构蛋白序列及结构是否存在差异.方法 通过将近年来世界各国EV-D68流行株（主要为中国株和美国株）的VP1核酸序列进行比对,利用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树进行分型,选取各型的代表株,利用其3C和3D蛋白的核酸序列构建进化树并同时利用其氨基酸序列进行同源建模,以进行蛋白质结构分析.结果 通过分析发现,EV-D68 Clade A、CladeB亚型毒株3D蛋白的三级结构均相同;而在3C蛋白的三级结构中,Clade B1亚型的毒株与Clade A、Clade B2和CladeB3亚型毒株存在差异.结论 3C蛋白的三级结构上的差异可能导致EV-D68 Clade B1亚型毒株的毒力和致病性高于Clade A、Clade B2和Clade B3亚型毒株.

利用反向遗传学技术构建H5N9重组流感病毒株

目的利用反向遗传学技术构建来源人感染禽流感病毒H5N1和H7N9HA和NA基因的H5N9亚型禽流感病毒。方法全基因合成A／Beijing／01／2003（H5N1）禽流感病毒HA基因片段和A／Zhejiang／DTID-ZJU10／2013（H7N9）禽流感病毒NA基因片段，插入到pHW2000载体，与携带有AfPuertoRico／8／34（H1N1）的6个内部基因的pHW2000重组质粒一起转染293T和MDCK混合细胞，拯救H5N9重组病毒。结果核酸测序、HA和NA基因转录和表达检测、细胞病变分析确定利用该反向遗传学系统可以成功拯救H5N9病毒。重组H5N9病毒在MDCK细胞上复制增殖能力低于相同方法拯救H1N1病毒。结论利用反向遗传学技术成功构建一株H5N9重组病毒。

人源化小鼠及其在病毒感染研究中的应用

人源化小鼠是指将人体细胞或组织移植入免疫缺陷小鼠，即保证不会产生免疫排斥，又可保证移植人的人体细胞／组织在小鼠体内作为合适的基质，适用于人体病原的感染及增殖，相较于普通动物模型可以获得更接近人体的较为可信的实验数据。目前人源化小鼠已经在病毒感染机制、诱导的免疫应答、抗病毒药物筛选及疫苗研发、基因治疗等方面的研究中获得应用，尤其对一些高度宿主特异性的病毒如HIV、HCV、DENV具有重大的研究价值。

肠道病毒-D68 VP1蛋白原核表达、纯化及抗原性的评价

目的 原核表达EV-D68结构蛋白VP1，并对其抗原性进行评价。方法 以肠道病毒68型P1基因为模板，设计引物扩增出目的片段VP1，将其连接至大肠杆菌表达载体pGEX-5X-1上。将重组表达载体pGEX-5X-1-VP1转化大肠杆菌表达菌株Rosetta （DE3）pLysS，对该工程菌进行诱导表达。菌体裂解后用SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定融合蛋白；对表达菌体进行超声破碎和亲和层析纯化；使用酶联免疫吸附试验方法评估目的蛋白与不同种属EV-D68阳性血清的结合能力及亲和力。结果 成功构建融合表达载体pGEX-5X-1-VP1，经过双酶切及测序鉴定均正确；成功表达和纯化出EV-D68 （Enterovirus D68, EV-D68） VP1融合蛋白，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，得到与预期蛋白相对分子质量为61 000大小一致的目的条带；纯化蛋白与不同种属的阳性血清可以特异性结合，与兔血清、恒河猴血清、小鼠血清的亲和力常数分别为1.6×106、3.9×105、3.1×106。结论 成功表达了EV-D68 VP1融合蛋白，为研究EV-D68 VP1蛋白的结构、功能及中和抗体筛选奠定基础。

昆明市EV71病毒分离株3D蛋白酶序列特征、病毒增殖特性分析

目的比较昆明市住院与门诊病例来源的10株EV71病毒分离株3D蛋白酶基因核苷酸及编码氨基酸序列的差异性与病毒毒力之间的关系。方法对分离自昆明市的10株EV71病毒3D蛋白酶基因核苷酸测序,利用Bioedit及Mega 6软件对测序结果进行序列比对及遗传特性分析。选取6株(住院病例分离株、门诊病例分离株各3株)绘制病毒增殖动力学曲线,取其中2株(住院及门诊病例来源各1株)病毒接种至Vero细胞进行空斑形成试验,比较不同病毒株形成的空斑形态大小。结果对10株EV71分离病毒株的3D蛋白酶基因进行核苷酸测序并构建进化树,5株住院病例分离株间遗传距离较近,在进化树上单独成为一簇;住院病例病毒分离株与门诊病例病毒分离株的氨基酸序列在140、197、299位点存在差异;住院病例病毒株在较短时间达到增殖高峰,空斑试验中形成的蚀斑直径大于门诊病例分离株。结论不同来源的EV71病毒分离株3D蛋白酶基因核苷酸序列及编码氨基酸序列存在差异,该差异与EV71病毒的增殖特性及毒力具有一定相关性。