炎症应答中去泛素化酶圆柱瘤蛋白相互作用分子筛选和验证

目的筛选炎症应答中与去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)相互作用分子,探究并验证CYLD和参与NF-κB信号通路调节的桥梁蛋白14-3-3家族分子之间是否在细胞内存在相互作用。方法通过免疫共沉淀(Co-IP)飞行质谱筛选可能与CYLD相互作用分子,在不同的刺激条件下诱导骨髓原代巨噬细胞向M1和M2极化,利用qRT-PCR、Western blotting技术检测CYLD及可能相互作用的候选分子14-3-3在巨噬细胞内的表达水平。结果CYLD抗体可以捕获14-3-3蛋白全部的7种亚型(β、γ、ε、η、ζ、δ、θ),提示CYLD很可能与14-3-3蛋白存在相互作用,选取质谱结果中得到特异性肽段最多的3种14-3-3亚型γ、ε、η(14-3-3γ/ε/η),检测结果显示在M0、M1、M2型巨噬细胞中CYLD和14-3-3γ/ε/η均有表达。构建了Myc-CYLD和Flag-14-3-3γ/ε/η真核过表达载体,用Flag抗体成功沉淀出CYLD蛋白,Co-IP结果提示CYLD和14-3-3γ/ε/η三种亚型均存在相互作用。免疫荧光实验显示CYLD和14-3-3在巨噬细胞内存在共定位现象。结论巨噬细胞炎症应答中CYLD和14-3-3γ/ε/η三种亚型可能存在物理上的相互作用。

机器人在温室中的应用研究

机器人是现代温室中重要的技术装备,研究其关键技术问题具有重要的意义。为此,对发达国家在温室采摘和喷雾机器人方面的先进技术以及我国温室机器人的研究现状进行了综述,并提出我国温室机器人在定位导航、精准作业方面存在的主要问题。同时,指出了未来温室机器人将向着智能化、小型化、一机多用等方向发展。

14-3-3η蛋白的生物信息学分析及原核表达

目的分析巨噬细胞不同极化状态下14-3-3η mRNA表达及其生物信息,并构建14-3-3η蛋白原核表达载体,为研究其在巨噬细胞活化中的作用提供实验基础。方法提取C57BL/6小鼠骨髓原代巨噬细胞mRNA,反转录后用实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测14-3-3η mRNA水平的改变。运用Prot Param tool、SOPMA等在线软件对14-3-3η氨基酸序列进行分析。以小鼠巨噬细胞cDNA为模板,采用PCR的方法扩增14-3-3η基因,插入pGEX-4T-3载体中,双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21菌株,用异丙基硫代半乳糖苷诱导其原核表达并纯化,SDS-PAGE法和Western blotting法对融合蛋白进行鉴定。采用Graphpad prism 5软件进行统计分析。样本比较均采用配对t检验。结果 M1型巨噬细胞14-3-3η表达降低,M2型趋势相反。生物信息学表明14-3-3η蛋白其二级结构中主要为α-螺旋(占62.60%)且疏水性较差(疏水系数为-0.607)。酶切和测序结果提示重组质粒pGEX-4T-3-14-3-3η构建成功。SDS-PAGE和Western blotting结果表明融合蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-14-3-3η成功表达和纯化。结论本实验对14-3-3η进行了初步的生物信息学分析,成功表达并纯化融合蛋白GST-14-3-3η,为14-3-3η在巨噬细胞极化上的功能研究奠定了实验基础。

去泛素化酶圆柱瘤基因调控肝脏相关疾病的研究进展

圆柱瘤基因(CYLD)是一种肿瘤抑制基因,其突变或缺失将会导致圆柱瘤的发生。由其编码的去泛素化酶CYLD蛋白是去泛素化酶家族的成员。CYLD通过移除底物蛋白K63连接的泛素链来改变靶分子的功能,并参与核因子κB、JNK和Wnt等信号通路的调控。现就近年CYLD的研究进展,尤其在肝脏相关疾病进展中的负向调控作用进行综述。