FAK基因的RNA干扰对肝星状细胞生物活性的影响

目的探讨靶向黏着斑激酶(FAK)基因的短发卡状RNA(shRNA)对大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化与增殖的影响。方法分别设计2对有小发卡结构的DNA序列及1对非特异对照序列,构建重组质粒载体,经阳离子聚合物介导转染HSC-T6细胞。通过real-timePCR与Western blot进行筛选鉴定,改良MTT法观察细胞增殖,Western blot检测HSC活化的标志物α-SMA的表达。结果shRNA1、shRNA2均能抑制FAKmRNA和蛋白表达(P<0.05),其中shRNA2对FAK基因抑制率达76.82%,且可明显抑制HSC-T6细胞α-SMA的表达及细胞增殖。结论靶向FAK基因的shRNA可以抑制HSC-T6细胞的活化与增殖。

黏着斑激酶与细胞迁移

细胞迁移过程始于细胞前端板状伪足的形成、外周黏附的建立、细胞体的收缩和尾部的解离。黏着斑激酶是一种非受体酪氨酸蛋白激酶,通过其激酶活性和"脚手架"的功能在细胞迁移的各个过程中发挥关键作用。现重点介绍黏着斑激酶介导的信号转导通路及其在调控细胞迁移方面的研究进展。

RNA干扰的体内应用研究进展

RNA干扰是由双链RNA引发的序列特异性基因沉默现象,目前已成为体外实验中抑制基因表达的首选方法。在体内实验中,近年也已经发表了上百篇将siRNA运用于哺乳动物的研究,说明RNA干扰同样可成为体内实验的强有力工具,并有望成为一种有效的疾病治疗手段。本文就RNA干扰体内实验中的影响因素、实验设计及近年研究进展等进行综述。

胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝组织中PTEN表达与肝星状细胞凋亡的关系研究

目的探讨胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝组织中磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)的动态表达与在体肝星状细胞(HSC)凋亡的关系。方法健康雄性SD大鼠50只,随机分为模型组(n=40)及假手术组(n=10)。模型组采用胆总管结扎法建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型,并分别于结扎后1、2、3、4周(每个时间点取10只)麻醉后留取肝组织。假手术组大鼠亦于相应时间麻醉后留取肝组织。采用免疫组化法测定大鼠肝组织中PTEN蛋白的表达;采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)及α-SMA免疫组化双染法检测在体活化HSC的凋亡情况。结果正常大鼠肝组织未见凋亡的HSC。随着肝纤维化程度加重,肝组织中PTEN蛋白的表达量逐渐减少(P<0.01),而活化HSC增多,凋亡HSC也增多。造模1、2、3、4周,大鼠肝组织的HSC凋亡指数(分别为4.57%±0.41%、4.02%±0.48%、3.45%±0.37%、2.88%±0.50%)逐渐减少(P<0.01)。大鼠肝纤维化组织中PTEN的蛋白表达量与在体HSC的凋亡呈显著正相关(r=0.76,P<0.01)。结论胆汁淤积性大鼠肝纤维化组织中PTEN的蛋白表达下调与在体活化HSC的凋亡减少相一致。

细胞外信号调节激酶在丹参单体IH764-3诱导肝星状细胞凋亡中的作用

目的:探讨丹参单体IH764-3对H2O2刺激的肝星状细胞(HSCs)增殖、凋亡等细胞行为的影响及细胞外信号调节激酶1(ERK1)在其中的调节作用。方法:应用体外细胞培养技术,采用直接细胞计数法、3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法测定HSCs增殖;透射电镜、膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术测定HSCs凋亡;分别应用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定ERK1蛋白及其mRNA的表达。结果:①H2O2具有刺激HSCs增殖的作用;②丹参单体IH764-3剂量依赖性抑制H2O2刺激的HSCs增殖;③Annexin-V/PI检测显示,10 mg/L,20 mg/L,30 mg/L及40 mg/L IH764-3干预48 h后各组凋亡率分别为6.35%、9.28%、15.10%、19.69%,而H2O2组为2.30%;30 mg/L IH764-3干预HSCs不同时间(12 h、24 h、48 h)的凋亡率分别是6.73%、10.34%、15.10%,呈时间依赖性;④丹参单体IH764-3干预组,HSCs的ERK1蛋白及其mRNA表达下调。结论:丹参单体IH764-3可以抑制HSCs增殖并诱导其凋亡;这种作用与其抑制ERK1蛋白和ERK1mRNA表达有关。

PTEN在肝纤维化大鼠肝组织中的动态表达

目的:探讨大鼠肝纤维化过程中肝组织PTEN的动态表达。方法:采用胆总管结扎法建立大鼠肝纤维化模型,HE及Masson三色染色检测肝脏组织学变化,免疫组织化学染色、Western blotting及实时荧光定量PCR技术检测大鼠肝组织的PTEN蛋白及mRNA表达。结果:大鼠肝纤维化模型成功建立,随着造模时间延长,肝纤维化程度逐渐加重,造模不同时间均可见不同程度的肝细胞变性坏死而导致正常肝细胞逐渐减少;免疫组织化学染色显示正常大鼠肝组织中PTEN广泛表达,主要表达于细胞浆,随着肝纤维化的进展,PTEN阳性表达细胞逐渐减少(P<0.01);Western blotting及实时荧光定量PCR显示造模1周、2周、3周及4周不同时间大鼠纤维化肝组织中PTEN蛋白及mRNA表达均显著低于假手术组(P<0.01),并随着肝纤维化的进展逐渐降低(P<0.01)。结论:大鼠纤维化肝组织中PTEN蛋白及mRNA表达均随着肝纤维化的进展逐渐降低,其下降程度与肝纤维化程度一致。

膜型基质金属蛋白酶-1在黏着斑激酶相关非激酶调控肝星状细胞胶原代谢中的作用

目的:探讨黏着斑激酶相关非激酶(FRNK)对纤维连接蛋白(FN)刺激的肝星状细胞(HSC)膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)表达的影响并探讨MT1-MMP在FRNK调控HSC胶原代谢中的作用。方法:应用体外细胞培养技术,脂质体介导法进行FRNK质粒瞬时转染;采用Western blotting法测定FRNK蛋白在瞬时转染时相应的表达,鉴定转染效果;分别应用Western blotting和RT-PCR方法测定MT1-MMP在HSC中的相应表达。结果:FRNK质粒成功转染HSC,于转染48h时,FRNK蛋白表达最强,P<0·05;FRNK转染后在基因水平上:MT1-MMP mRNA表达明显增加;翻译蛋白水平上:FRNK质粒转染HSC48h后,MT1-MMP蛋白表达量显著升高。结论:脂质体介导下FRNK质粒转染,可使外源性FRNK在HSC内大量表达,FRNK可能通过上调MT1-MMP值来抑制HSC胶原合成。

大鼠肝纤维化组织中PTEN蛋白的定位分布

目的探讨大鼠纤维化肝组织中PTEN蛋白的定位分布及其在肝纤维化病理过程中的作用。方法结扎胆总管建立大鼠肝纤维化模型;用免疫组织化学染色测定大鼠肝组织中PTEN及α-SMA蛋白的定位分布;免疫荧光双标记共聚焦激光扫描显微术测定大鼠肝组织中活化肝星状细胞(HSC)的PTEN蛋白的定位分布。结果随着肝纤维化的发展,大鼠肝纤维化组织中α-SMA阳性细胞明显增多(P<0.01),PTEN蛋白表达逐渐减少(P<0.01);PTEN蛋白在活化HSC广泛表达,主要表达于细胞质,随着肝纤维化的加重,表达PTEN的活化HSC占总的活化HSC的比例逐渐减少(P<0.01)。结论大鼠肝纤维化组织中PTEN阳性表达细胞减少,减少程度与HSC的活化、增殖呈负相关。

2010年消化系统疾病重要诊疗进展

2010年是生命科学与生物技术飞速发展的一年,新进展、新技术、新成果层出不穷。科学技术的突飞猛进、网络的方便快捷以及大型国际会议的陆续召开,将世界最先进最前沿的科技成果带给我们,并为我国消化病学专家之间及与世界各国专家之间的交流提供了广阔平台。现将2010年度国内外消化领域研究进展简要介绍如下。

门脉高压性胆病诊治进展

门脉高压性胆病(PHB)为继发于门静脉高压特别是肝外门静脉阻塞患者的肝内、外胆管和/或胆囊壁、胆囊管的异常改变.PHB的发病机制尚不完全清楚,目前认为与门静脉海绵状血管瘤曲张压迫胆管和胆管壁缺血性损害有关.约20%PHB患者存在胆道系统症状,且与年龄、疾病持续时间、胆石症的发生频率以及肝功能异常相关.磁共振胆管造影术和门静脉造影术是PHB患者的首选检查方法,有症状者可予内镜或外科手术治疗,治疗目的为降低门脉高压和解除梗阻.

膜型基质金属蛋白酶1在黏着斑激酶相关非激酶诱导肝星状细胞凋亡中的作用

目的应用黏着斑激酶相关非激酶(FRNK)表达质粒瞬时转染纤维连接蛋白(FN)刺激的肝星状细胞(HSC),探讨膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)在FRNK诱导HSC凋亡中的作用。方法在体外,以FN刺激HSC增殖,采用脂质体介导的方法用FRNK表达质粒瞬时转染HSC,应用膜联蛋白/碘化丙啶双标记流式细胞术和透射电镜技术检测细胞的凋亡,蛋白免疫印迹及RT-PCR方法检测FRNK、FAK、p-FAK(Tyr397)、MT1-MMP蛋白及其mRNA表达。结果FRNK表达质粒成功转染HSC,在翻译后水平抑制FAK磷酸化。与空质粒组比较,FRNK表达质粒转染HSC 48小时后,HSC凋亡率由(9.28±1.05)%增加至(25.37±1.92)%(P<0.01)。FRNK抑制FAK磷酸化后在翻译和转录水平上调MT1-MMP表达,2.26±0.14 vs 1.09±0.15(P<0.01);1.58±0.18 vs1.00±0.10(P<0.01)。结论在脂质体介导下瞬时转染FRNK表达质粒可诱导HSC发生凋亡,上调MT1-MMP可能是其机制之一。

嗜酸细胞性食管炎的诊断和治疗进展

嗜酸细胞性食管炎（Eosinophilic Esophagitis，EE）是一种以食管壁有嗜酸性粒细胞浸润为特征的炎症性疾病，常表现为吞咽困难、餐后恶心、呕吐、腹痛及腹泻，可出现成人体重下降或婴幼儿成长障碍。本病临床罕见，国内病例较少，且临床表现及辅助检查均无特异性，故极易误诊。

FAK-ERK信号转导通路在FRNK抑制肝星状细胞胶原合成中的作用

目的:探讨FAK-ERK信号转导通路在黏着斑激酶相关非激酶(FAK-related non-kinase,FRNK)质粒转染抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)胶原合成中的作用.方法:在体外,以FN诱导HSCs增殖,采用脂质体介导的方法用FRNK表达质粒瞬时转染HSCs,利用3H-Pro掺入技术测定HSCsⅠ型胶原的合成,Western blot及RT-PCR方法检测FRNK、FAK、p-FAK(Tyr397)、ERK蛋白和mRNA的表达.结果:FRNK表达质粒成功转染HSCs,在翻译后水平抑制FAK磷酸化.在FRNK转染HSC48h后胶原合成能力较空质粒组显著下降(498.17±73.20vs748.33±61.30,P<0.01).FRNK抑制FAK磷酸化和在翻译和转录水平抑制ERK1、p-ERK的表达,而FN则促进FAK和ERK1、p-ERK在翻译和转录水平的表达.结论:FRNK可以使HSCs胶原合成能力降低,FAK-ERK信号转导通路可能发挥了负调控作用.

FRNK高表达诱导HSC凋亡后MMP-2及TIMP-2的变化

目的探讨黏着斑激酶相关非激酶(FRNK)诱导肝星状细胞(HSC)凋亡后基质金属蛋白酶-2及其抑制剂的变化。方法在体外,以纤维连接蛋白(FN)刺激HSC增殖,在脂质体介导下用FRNK表达质粒瞬时转染HSC,应用膜联蛋白/碘化丙啶双标记流式细胞术和透射电镜检测细胞的凋亡,Western blot检测FRNK、FAK、p-FAK(Tyr397)、MMP-2、TIMP-2蛋白表达。结果FRNK表达质粒成功转染HSC,在翻译后水平抑制FAK磷酸化。与空质粒组比较,FRNK表达质粒转染HSC 48 h后,HSC凋亡率由(9.28%±1.05%)增加至(25.37%±1.92%)(P<0.01);同时,FRNK在翻译水平上调MMP-2表达、抑制TIMP-2表达。结论在脂质体介导下瞬时转染FRNK表达质粒可诱导HSC发生凋亡,MMP-2/TIMP-2比值上调可能参与了该调节过程。

浅议电气自动化控制技术的应用与发展

电气自动化技术是与电子和信息技术紧密结合在一起的一门电气工程应用技术学科，随着电子技术、信息网络、智能控制的飞速发展，使得电气自动化经历了从无到有、从发展到成熟的过程。本文主要是对电气自动化控制技术的发展趋势，电气自动化控制系统的特点、功能和设计理念，节能设计等进行了分析，以供同仁参考!

体外RNA干扰下调黏着斑激酶表达对HSC—T6细胞黏附与迁移的影响

目的探讨特异性阻断黏着斑激酶（FAK）表达对纤维连接蛋白刺激的肝星状细胞（HSCT6）黏附与迁移的影响。方法构建靶向FAK的RNA干扰重组体，在阳离子聚合物介导下转染大鼠肝星状细胞系HSC-T6，筛选出可高效抑制FAK表达的重组质粒；荧光实时定量PCR和Western blot检测FAK基因敲除效果；甲苯胺蓝染色法检测细胞黏附；划痕修复实验和改良的Boyden双腔系统检测细胞迁移。多组间均数差异性比较采用单因素方差分析。结果成功构建并筛选出可高效抑制FAK的质粒表达载体。质粒转染后，FAKmRNA和蛋白表达分别下降了76．82％和72．53％，同时，PFAK（Tyr^397）蛋白表达下降了62．71％；FAK表达下调可明显抑制HSC—T6细胞黏附，抑制率约58．69％；FAK基因沉默可显著抑制纤维连接蛋白诱导的HSC迁移，使细胞迁移距离降低了58．27％，跨膜迁移细胞数减少了83．70％。结论RNA干扰技术可选择性下调HSC中FAK的表达，并可显著抑制HSCT6的黏附和迁移。