家蝇幼虫抗菌相关蛋白/多肽的诱导及抗菌活性分析

对家蝇Muscadomestica 3龄幼虫进行针刺、带菌针刺、热激和超声 4种处理 ,并于处理后不同时间分别收集提取家蝇幼虫体内耐热总蛋白 ,比浊法测定其抗菌活性 ,经逐步回归分析确定抗菌相关蛋白 多肽。结果表明 ,4种处理均能诱导家蝇幼虫产生抗菌物质 ,其中表观分子量为 2 2kD的蛋白对藤黄微球菌和大肠杆菌均有抗菌作用 ,5 0kD ,13kD ,2 6kD ,7kD的蛋白抗菌活性具有专一性。还发现一种 37kD的蛋白对抗菌活性有负作用 。

一类潜在的新药——抗菌肽

抗菌肽是生物防御系统产生的一类对抗外源性病原体的肽类物质,具有抗细菌、真菌、霉菌、病毒、原虫、癌细胞等多种活性,且不易产生耐药性,具有广阔的应用前景。本大概述了抗菌肽的分类、结构特征、作用机制、药用前景及存在的问题等5个方面的内容。

不同提取工艺对家蝇幼虫蛋白粗提液抗菌活性的影响

利用不同条件提取诱导过的家蝇Muscadomestica 3龄幼虫的总蛋白 ,并用平板扩散法测定所得蛋白粗提液的抗菌活性。结果表明 ,收集幼虫时的处死温度、沸水浴时间及提取液的pH值均对家蝇幼虫粗提液的抗菌活性有明显的影响。

凝胶过滤层析参数对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响

考察了凝胶过滤介质、层析柱直径、柱床高度和洗脱流速对家蝇Muscadomestica蛋白粗提液分离效果的影响 ,结果表明 :凝胶过滤介质种类、层析柱直径、柱床高度、洗脱流速均能不同程度地影响家蝇蛋白粗提液的分离效果。在实验范围内 ,选择1 3cm直径、4 0cm柱床高度的SephadexG 75 ,以 0 4mL min的流速洗脱时 ,对家蝇蛋白粗提液的分离效果比较理想。

家蝇幼虫中与抗菌功能相关的蛋白和多肽的分析

目的 研究家蝇幼虫体内与抗菌功能相关的蛋白和多肽。方法 对家蝇 3龄幼虫进行针刺、带菌针刺、热激、超声 4种处理 ,于处理后 6、16、2 4、4 8、6 5h分别收集提取耐热水溶蛋白 ,比浊法测定抗菌活性 ,经逐步回归分析确定抗菌相关蛋白和多肽。结果 4种处理均能诱导家蝇幼虫产生抗菌物质 ,其中表观分子量为 2 0kDa、2 2kDa的蛋白对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌均有抗菌作用 ,13kDa、16kDa、2 6kDa蛋白只对上述两种菌中的一种有作用 ,37kDa、4 4kDa的蛋白对抗菌作用具有显著负贡献。结论 家蝇幼虫经过诱导后 ,会有多种与抗菌活性相关的蛋白和多肽开始表达或加强表达 ,它们彼此合作 ,共同建立一个完整的防御体系。

检测SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中家蝇蛋白的新方法——海波银染法

介绍一种检测SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳中家蝇幼虫蛋白的新方法———海波银染法。该方法对传统银染方法中的试剂与步骤加以改进 ,省略了乙醇固定与洗涤步骤 ,只需 2 0min即可完成全部染色过程 ,且仅在国产分析纯试剂及普通操作条件下 。

超声诱导对家蝇幼虫基因组DNA影响的谱学研究

超声诱导3日龄家蝇幼虫后提取对照和处理组的基因组DNA,利用紫外光谱、荧光光谱、红外光 谱、核磁共振谱对其结构进行分析,并利用PCR对基因组中attacin基因的3’端序列进行测序比较。结果表 明,超声诱导能够影响家蝇幼虫基因组DNA的二级结构和碱基堆积状态,进而在DNA复制时造成碱基错 配最终导致DNA序列发生改变,但是超声诱导对DNA的化学基团和化学键没有明显的影响。

克百威和乙霉威对家蝇幼虫体内AChE活性的影响

采用体内染毒的方法,研究了克百威和乙霉威对家蝇幼虫体内乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响,对以AChE活性抑制率作为生物学标记物来检测环境中农药残留的可行性进行了初步探讨.结果表明,同一时间内,对AChE活性的抑制率随着农药浓度的升高而增加;农药处理后,随着时间的延长,对AChE活性的抑制率逐渐降低.AChE活性抑制率可以作为生物学标记物.

一种家蝇幼虫热稳定抗菌肽的分离纯化

本文对家蝇三龄幼虫进行了超声处理 ,以诱导其产生抗菌物质 ..通过高温处理、酸性处理后 ,抗菌物质粗提中大量的热不稳定蛋白和酸性蛋白发生沉淀而被去除 .将经过上述处理的粗提液经过一步 Sephadex G-75凝胶过滤层析、两步 CM-Sepharose阳离子交换层析后 ,得到一个单一的具有抗阳性球菌的峰 .SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示为一条带 ,相对分子质量大约为 70 0 0 ,将其命名为 H1 .H1为一种热稳定的碱性抗菌多肽 .

昆虫天然免疫反应分子机制研究进展

昆虫体内缺乏高等脊椎动物所具有的获得性免疫系统,只能依赖发达的天然免疫系统抵抗细菌、真菌、病毒等外源病原物的侵染。本文概括了昆虫天然免疫反应发生和作用的分子机制相关进展,重点阐述了重要免疫相关因子在昆虫天然免疫反应中的功能和作用机制。昆虫天然免疫反应分为体液免疫和细胞免疫两种,二者共同作用完成对病原物的吞噬(phagocytosis)、集结(nodulation)、包囊(encapsulation)、凝结(coagulation)和黑化(melanization)等。当昆虫受到外界病原物的侵染时,首先通过体内的模式识别蛋白(pattern recognition proteins/receptor,PRPs)识别并结合病原物表面特有的模式分子(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs),继而一系列包括丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂在内的级联激活反应被激活和调控,产生抗菌肽、黑色素等免疫效应分子,清除或杀灭外源物。抗菌肽是一类小分子量的阳离子肽,具有广谱抗菌活性,针对不同类型的病原物,抗菌肽的产生机制也不尽相同。昆虫体内存在着两种信号转导途径调节抗菌肽的产生:一是由真菌和大部分革兰氏阳性菌激活的Toll途径;二是由革兰氏阴性菌激活的Imd途径(immune deficiency pathway)。这两个途径通过激活不同转录因子调控不同抗菌肽基因的表达参与昆虫体内的天然免疫反应。

家蝇攻击素(Attacin)基因的克隆与表达

通过同源克隆策略并结合cDNA末端快速扩增 (RACE)技术 ,克隆到了编码家蝇攻击素 (Attacin)基因的全长cDNA序列 (GenBank登陆号 :AY4 6 0 10 6 ) ,并对相应的氨基酸序列进行了序列比对 ,对系统关系等进行了生物信息学分析。家蝇Attacin的cDNA全长 778bp ,其中包括 6 2 7bp的开放式读码框 (ORF) ,4 4bp的 5′末端非编码区 (5′UTR)和 10 7bp的 3′末端非编码区 (3′UTR) ,相应的蛋白产物含 2 0 8个氨基酸 ,与其他双翅目昆虫的Attacin具有很高的相似性 ,约 5 0 %～ 70 %。以邻接法 (Neighbor Joining ,NJ)所构建的系统关系表明 ,家蝇的Attacin与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先。应用半定量RT PCR的方法 ,研究家蝇幼虫在受到外源刺激后Attacin基因的表达 ,结果表明 ,在家蝇幼虫体内Attacin基因呈诱导型表达 。

家蝇蛹血淋巴抗菌活性的诱导及相关蛋白/多肽的表达规律

对家蝇蛹血淋巴的抗菌活性进行了诱导 ,并用统计学逐步回归的方法和多项式回归的方法确定了抗菌相关蛋白 /多肽 ,研究了其表达规律 .结果表明 ,针刺、带菌针刺和超声波均能诱导家蝇蛹产生抗 G+球菌的物质 ,而对G- 杆菌无效 .在分子量低于 1 80 0 0的蛋白 /多肽中 ,有两种物质 ( R5、R6)对抑菌活性有显著影响 ,它们的表观分子量分别在 1 2 0 0 0和 76 5 0左右 ,这两种蛋白 /多肽均在诱导下表达 .其中 ,R6对抑菌活性有极显著正贡献 ,而R5对抑菌活性有显著负贡献 ,推测

通过负压花粉管法将耐盐基因HVA1转入小麦的研究

H VA1基因编码的 Hva1蛋白属于植物晚期胚胎发生富集蛋白 (late em bryogenesis abundant proteins,L EA蛋白 ) ,L EA蛋白可以保护植物免受盐渍及干旱的危害。本研究利用携带有单子叶植物启动子及 H VA1基因的质粒载体 ,用首创的负压花粉管法转化单子叶植物小麦。通过对小麦 T1 代的 PCR检测和点杂交检测 ,证明目的基因已经转入 ,转化率高达 14 .1%。本实验所用的负压花粉管通道法 ,操作简单 ,转化效率较高 ,不需要体外再生 。

家蝇幼虫体内过氧化物酶过氧化氢酶抗坏血酸过氧化物酶与抗药性的关系——I.H_2O_2对酶活性的影响

采用室内饲养试验方法,研究了H2O2对家蝇幼虫体内过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(AsA-POD)活性的影响。结果表明,外源H2O2能不同程度地影响以上3种酶的活性,但变化规律却有明显差异:CAT活性变化的基本趋势是随着龄期的增加而递增,处理组最大值分别是对照组的1.2、1.26、1.47倍,另外在1、2龄幼虫中CAT活性出现了对照比处理高的现象,而3龄幼虫则没有出现。经H2O2处理后的1、3龄幼虫体内的POD出现了2个活性峰,1龄幼虫被处理后,在第1个活性峰出现的时间内对照明显比处理高,且持续时间约为5h,然后酶活性骤然上升,活性高峰值是对照组的6.8倍;2龄幼虫只有1个活性峰,是对照组的3.68倍;3龄幼虫体内的POD也有2个活性峰出现,分别是对照组的4.9、2倍。AsA-POD活性在整个实验过程中没有出现对照高于处理的现象,1、2龄幼虫经过处理后出现了2个活性峰,分别是对照组的1.3、1.3倍和2.08、1.73倍,3龄幼虫则只有1个活性峰,是对照组的1.8倍。

单酶法RTP-CR检测马铃薯纺锤块茎类病毒

根据Taq酶既有聚合酶活性又有反转录酶活性的特点 ,探索了只在Taq酶单独作用下完成RT PCR反应的条件 ,以达到对马铃薯纺锤块茎类病毒 (PSTV)的快速检测。结果表明 ,反转录阶段退火温度在 37℃、循环数不少于 10次的情况下 ,PCR扩增能得到一条相关特异带。经过嵌合式PCR证明 ,这条带为PSTV的特异带。与其他检测方法相比 ,用单酶法RT PCR检测PSTV步骤简单 。

亚洲玉米螟C型凝集素CTL6的克隆和功能分析

【目的】鉴定出一种新的亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)C型凝集素(C-type lectin),并对其功能进行初步研究。【方法】通过生物信息学分析,从亚洲玉米螟转录组中筛选得到一个可能的C型凝集素基因,命名为CTL6。利用RT-PCR技术分析该基因在亚洲玉米螟不同龄期、不同组织及不同病原物诱导下的表达模式。借助原核及杆状病毒真核表达系统产生重组CTL6蛋白,并利用细菌凝集实验对其功能进行初步研究。【结果】CTL6基因c DNA全长序列为1 034 nt,其中完整开放阅读框为945 nt。推导的CTL6多肽序列包括314个氨基酸残基,N端含有由22个氨基酸残基组成的信号肽。CTL6成熟肽中含有两个串联的糖识别结构域,与烟草天蛾Manduca sexta的IML-2(Immulectin-2)同源性最高。RT-PCR结果显示,CTL6在亚洲玉米螟5龄幼虫期转录水平最高,卵期其次,不同组织中则是在脂肪体中转录水平最高,呈诱导性表达。纯化的CTL6重组蛋白对大肠杆菌Escherichia coli具有一定的凝集作用。【结论】鉴定到的亚洲玉米螟CTL6是一种典型的C型凝集素,重组CTL6蛋白可能参与了亚洲玉米螟对病原菌的凝集作用。

大米草 (Spartina anglica)中一种盐诱导cDNA的分离和鉴定(英文)

通过改进的 DDRT-PCR技术 ,从大米草 (Spartina anglica)中分离和鉴定了盐诱导 c DNA序列 KD1 .KD1核苷酸序列显示 ,5′-末端是一个含有 4 44个核苷酸的开放阅读框架 (ORF) ,3′-末端是富含 AT的非转录区 .其编码的氨基酸序列与类调渗蛋白和致病相关蛋白相比 ,分别有 63 %、3 4 %同源 .结果表明 。

小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫天然免疫反应的影响

【目的】探讨昆虫病原线虫小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All侵染对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda幼虫天然免疫反应的影响。【方法】借助倒置显微镜观察和鉴定草地贪夜蛾幼虫的血细胞类型,并对小卷蛾斯氏线虫侵染后不同时间的草地贪夜蛾幼虫血细胞总数目进行统计;通过倒置显微镜观察草地贪夜蛾幼虫对侵入的小卷蛾斯氏线虫的包囊反应;利用倒置荧光显微镜观察小卷蛾斯氏线虫侵染后的草地贪夜蛾幼虫血细胞对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的吞噬活性;检测小卷蛾斯氏线虫侵染后的草地贪夜蛾幼虫血淋巴中酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性、体内抗菌肽基因相对表达水平以及血浆的抗菌活性。【结果】从草地贪夜蛾幼虫体内共发现5种不同类型的血细胞,分别为原血细胞、粒细胞、类绛色细胞、珠血细胞和浆血细胞。注射1μL侵染期(infective juveniles,IJs)小卷蛾斯氏线虫(3 IJs/μL)后9和12 h,草地贪夜蛾幼虫的血细胞总数目显著增多。草地贪夜蛾幼虫的血细胞不能包囊活的以及冷处死的小卷蛾斯氏线虫,但可以包囊热处死的线虫。活的小卷蛾斯氏线虫会显著抑制草地贪夜蛾幼虫血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬活性,但冷处死和热处死的线虫不能。注射1μL(3 IJs/μL)小卷蛾斯氏线虫后,草地贪夜蛾幼虫血淋巴PO活性总体呈“下降-升高-下降”变化趋势;体内抗菌肽基因Attacin-A2,Attacin-B1,Cecropin-B3,Cecropin-D,Gallerimycin,Gloverin-3以及Lebocin-2的表达水平在线虫侵染后12 h时显著上调,24 h时恢复到对照水平或低于对照水平;血淋巴抗菌活性水平在小卷蛾斯氏线虫侵染后12 h时显著升高,24 h时与对照无显著差异。【结论】小卷蛾斯氏线虫在侵入早期会抑制草地贪夜蛾幼虫的天然免疫反应来建立感染;随后草地贪夜蛾的免疫系统会被激活试图抵御小卷蛾斯氏线虫的侵染;后期随着线虫的成功定殖,草地贪夜蛾的免疫系统最终被抑制或破坏。本研究所得结果为进一步揭示线虫-草地贪夜蛾的免疫互作机理奠定了基础,也为改善昆虫病原线虫对草地贪夜蛾的防治效果提供了理论依据。

一种大量提取家蝇幼虫基因组DNA的新方法

介绍1种大量提取家蝇幼虫基因组DNA的新方法,该法由提取植物DNA的CTAB法改进而成,利用该法可在数小时内得到高质量的家蝇幼虫基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳和紫外分析表明,该法所得DNA的完整性和纯度均可满足分子生物学水平的一般要求。

昆虫天然免疫反应研究前沿

昆虫天然免疫反应分为体液免疫和细胞免疫两种,二者共同作用抵御细菌、真菌、病毒等外源病原物的侵染。体液免疫反应主要包括黑色素形成和抗菌肽产生两种机制,细胞免疫反应包括吞噬、集结和包囊等作用类型。在昆虫天然免疫反应中,昆虫模式识别蛋白负责识别并结合外源物表面特有的模式分子,丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、各种配体、受体等负责级联信号途径的激活和调控,抗菌肽、黑色素等效应分子则负责对入侵物的杀灭和清除。本文根据国外和作者自己的研究,综述了昆虫天然免疫反应的研究进展,并针对该领域最新的研究动态展望了昆虫肠道免疫、昆虫免疫致敏以及不完全变态昆虫免疫学等这些研究前沿。