重组SARS-CoV-2蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒的研制

目的制备重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒,并进行验证。方法选用中国食品药品检定研究院(简称中检院)制备的羊抗S蛋白多克隆抗体作为包被抗体,从4株单克隆抗体(14C8、15F9、17A7和20D8)中筛选出1株具有受体结合域(receptor-binding domain,RBD)结合活性高,且广谱抗主要突变株的单克隆抗体作为酶标抗体(用HRP标记),制备重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA法通用检测试剂盒,并采用棋盘滴定法对包被抗体稀释度(1∶125~1∶4000)和酶标抗体稀释度(1∶250~1∶32000)进行优化。验证试剂盒的专属性、线性范围、准确性、精密性及耐用性。将制备的通用检测试剂盒分发给12个实验室,检测各实验室自制的不同表达系统(CHO细胞、毕赤酵母、Sf9细胞或大肠埃希菌)和目的蛋白(RBD或S蛋白)的15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液(包括11批以WT株为参考序列设计的原液及4批以Beta、Gamma和Delta变异株设计的原液)。结果确定包被抗体最佳稀释度为1∶500,单克隆抗体20D8作为酶标抗体,最佳稀释度为1∶4000。通用检测试剂盒与严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)病毒的重组S蛋白无交叉反应;第1代重组SARS-CoV-2蛋白疫苗抗原国家标准品(简称国家标准品)浓度在0.16~2.50 U/mL范围内,与A450/630呈良好的线性关系,线性方程为:y=0.791 x-0.1004,R2=0.9937;0.16~2.50 U/mL国家标准品重复6次检测结果回收率均在95%~104%之间,变异系数(coefficient of variation,CV)均<15%;2名实验员在不同时间重复3次检测结果的CV为4.4%~6.6%;在不同温度及时间条件下检测结果回收率均在80%~120%范围内。15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液抗原含量的检测结果与国家标准品均具有良好的平行性。结论本研究建立的抗原含量通用检测试剂盒具有良好的专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于重组SARSCoV-2蛋白疫苗抗原含量的检测。

柯萨奇病毒A组6型通用抗原检测试剂盒的建立

目的建立柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)疫苗抗原定量检测试剂盒,用于CV-A6疫苗以及含有CV-A6的手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)多价疫苗的研发及质量控制。方法分别采用多个CV-A6毒株与多家企业的CV-A6抗原,通过结合能力和中和能力比较,从6个单克隆抗体(9H1、3D9、10F4、5A6、6D12和10G8)中筛选出具有广谱高结合能力及高中和能力的单克隆抗体,建立ELISA法CV-A6抗原定量检测试剂盒。对试剂盒进行线性、专属性、准确度、精密度、耐用性等验证。将试剂盒分发国内主要CV-A6疫苗研发企业,由各企业分别采用该试剂盒对各自制备的CV-A6疫苗原液以及生产工艺各中间环节制品进行CV-A6抗原含量检测,考核试剂盒适用性。结果以多克隆抗体CV-A6-3I作为包被抗体,最佳浓度为1∶8 000,以5A6单克隆抗体作为酶标抗体,最佳浓度为1∶8 000;包被条件为4℃过夜;封闭液为10%FBS+PBST+5%蔗糖,37℃封闭2 h;抗体稀释液为ED-33,酶标抗体作用条件为37℃1 h;显色条件为37℃10 min。建立的CV-A6抗原检测试剂盒线性范围为11~178 ng/mL,线性良好,定量检出限为11 ng/mL;与同为小RNA病毒科的CV-A16、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)、CV-A10、EV-A71以及MEM、DMEM和PBS缓冲液等均无交叉反应,专属性良好;检测回收率在83%~114%之间,单个实验员和2个实验员重复检测CV均小于15%,准确度、重复性和中间精密度均良好;抗原或酶标抗体孵育时间上下浮动5 min或反应温度上下浮动2℃,回收率在83%~107%之间,耐用性良好。该试剂盒检测4个企业制备的CV-A6疫苗原液和疫苗制备过程中的中间制品均具有良好的线性和平行性,提示该试剂盒对国内主要CVA6疫苗及中间制品均具有良好的适用性。结论本研究采用具有高效价、广谱中和活性的单克隆抗体和多克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA法CV-A6疫苗抗原定量检测试剂盒。经方法验证和适用性研究,证明该试剂盒各项指标良好,可作为CV-A6疫苗通用试剂盒用于CV-A6抗原含量检测,为CV-A6疫苗和HFMD多价疫苗研发及质量控制提供了可靠的检测手段。

猪FTO的转录调控研究

肥胖是世界上最普遍的非流行性疾病之一,由于其与胰岛素抵抗、II型糖尿病、心血管疾病和某些癌症有关而被列为公共健康的一大杀手。FTO就是通过全基因组关联分析发现的一个与体重指数和肥胖有关的肥胖候选基因。本实验克隆了猪FTO基因的启动子序列和全长CDS序列。