胞外DNA是耻垢分枝杆菌生物被膜的主要成分

目的本实验以无致病性的耻垢分枝杆菌Mc^2 155为结核分枝杆菌模型菌进行生物被膜成分研究。方法利用24孔细胞培养板建立体外耻垢分枝杆菌生物被膜培养模型；借助DNaseⅠ作为eDNA抑制剂分析其在生物被膜的存在情况，通过结晶紫染色对生物被膜进行定量；早期加入外源基因组DNA对生物被膜的影响进行评估；利用荧光显微镜考察SYTOX orange标记生物被膜的主要成分胞外DNA（eDNA）。结果体外培养的耻垢分枝杆菌Mc^2 155能形成典型生物被膜；早期加入DNaseⅠ明显抑制了生物被膜的产量；早期加入基因组DNA有利于提高生物被膜产量。特异染料SYTOX orange能对耻垢分枝杆菌生物被膜染色，说明eDNA是耻垢生物被膜的主要成分。结论本研究首次证明eDNA是耻垢生物被膜的主要成分，这为治疗分枝杆菌感染和耐药控制提供了新的思路。

三药组合抑制由α-溶血素导致的巨噬细胞炎性因子激活

为了考察一种新型三药组合(氯唑西林、硫利达嗪和四环素)对金葡菌α-溶血素分泌的影响,以及探讨该三药组合对由金葡菌α-溶血素引起巨噬细胞炎症发生的抑制作用。试验采用抗菌药物敏感实验、三维棋盘法、溶血实验、Western blot实验方法。结果表明:三药组合显示出协同杀菌作用;三药组合能够显著协同抑制α-溶血素的分泌;三药组合可显著抑制由金葡菌α-溶血素引起巨噬细胞raw264.7相关炎症通路MAPKs、NF-κB、NLRP3蛋白的表达。说明该新型三药组合通过抑制金葡菌α-溶血素的分泌,进而阻断金葡菌α-溶血素引起的巨噬细胞炎性因子的激活。

胰岛素联合利奈唑胺抑制糖尿病细菌性肺炎的机制研究

试验旨在研究胰岛素联合利奈唑胺是否同时具有降糖、抗菌以及抑制α-溶血素活性,从而抑制糖尿病细菌性肺炎。本研究通过体外试验探讨了联合用药对高糖和金黄色葡萄球菌α-溶血素共同诱导的巨噬细胞炎症反应的作用,并探讨其机制。通过药物敏感试验测定最小抑菌浓度(MIC);通过检测D600 nm值绘制生长曲线来考察胰岛素、利奈唑胺单独或联合胰岛素的抗菌活性;通过溶血试验考察药物组合对α-溶血素活性的抑制效果;通过细胞毒性试验判定药物组合的体外安全性;借助Western blotting药物组合对炎症通路蛋白的作用。药物敏感性试验结果显示,胰岛素组未检测到金黄色葡萄球菌8325-4株和DU1090株的MIC值,利奈唑胺和胰岛素+利奈唑胺药物组合对这两种金黄色葡萄球菌的MIC均为0.5μg/mL;由生长曲线结果可知,胰岛素不抑制正常组和高糖组金黄色葡萄球菌的生长,但是在利奈唑胺组和胰岛素+利奈唑胺药物组合组,0.25~4μg/mL利奈唑胺可抑制金黄色葡萄球菌的生长;溶血试验结果显示,正常组和高糖组胰岛素均不抑制α-溶血素活性,0.25~4μg/mL利奈唑胺均可抑制α-溶血素活性;细胞毒性试验显示,正常组和高糖组,细胞存活率均大于88.038%,50 nmol/L胰岛素、0.25μg/mL利奈唑胺、50 nmol/L胰岛素+0.25μg/mL利奈唑胺药物组合可提高高糖诱导的MH-S细胞存活率;Western blotting结果显示,50 nmol/L胰岛素单独使用对高糖和α-溶血素共同诱导小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)中TLR2、MAPKs及NLRP3蛋白的表达水平没有抑制作用,而50 nmol/L胰岛素联合0.25μg/mL利奈唑胺可降低高糖和α-溶血素共同诱导MH-S细胞中上述蛋白的表达水平,其抑制作用比单独使用利奈唑胺时显著。综上所述,胰岛素联合利奈唑胺可通过降糖、抗菌和抑制α-溶血素活性的方式抑制小鼠肺泡巨噬细胞炎症反应。

基于CRISPR/Cas9技术的法尼醇X受体缺失株的构建及其对HeLa细胞增殖的影响

试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建法尼醇X受体(FXR)基因稳定敲除细胞株,并考察其对HeLa细胞增殖的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计3对特异性识别FXR基因第1外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),以PX459质粒为载体,构建真核重组表达质粒。酶切和测序鉴定后将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,再用实时荧光定量PCR检测HeLa细胞FXR基因敲除稳定株中FXR的表达量,并用Western blotting方法鉴定HeLa细胞FXR基因敲除效果。最后用结晶紫染色试验检测FXR基因敲除对HeLa细胞增殖的影响。结果显示,经测序后,3对sgRNA位置与方向均正确插入到PX459质粒载体内,成功构建出重组表达质粒PX459-sgRNA;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,转染后筛选出的细胞中FXR蛋白不表达,表明构建出稳定敲除FXR基因的HeLa细胞株;结晶紫试验结果发现,FXR基因敲除的HeLa细胞染色深度明显低于正常HeLa细胞,FXR基因敲除HeLa细胞孔D 595 nm值极显著低于野生型HeLa细胞孔(P<0.01),说明HeLa细胞FXR基因敲除株的增殖能力较正常HeLa细胞显著降低。本试验利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源FXR基因敲除细胞株,且FXR基因敲除对癌细胞增殖具有显著抑制作用,为研究FXR的功能和作用机制提供了细胞模型,并为研究FXR在相关癌症发生发展中的作用奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv3519表达与其生物被膜形成能力的研究

采用结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜的形成能力,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测生物被膜态的不同结核分枝杆菌Rv3519表达水平,分析Rv3519基因表达与结核分枝杆菌生物被膜形成能力的关系。结果表明:临床分离株产膜能力较H37Rv明显偏低,差异显著(P<0.01);临床分离株之间生物被膜产量差异不显著(P>0.05);生物被膜态的分离株较标准株Rv3519基因表达量偏低,差异显著(P<0.01)。说明结核分枝杆菌生物被膜形成能力与Rv3519基因表达水平相关,Rv3519基因可以作为结核分枝杆菌生物被膜形成能力的潜在分子诊断标志。

巨噬细胞通过产生胞外陷阱捕获并杀伤单增性李斯特菌

为了研究产单核细胞增生性李斯特菌(Lm)能否引起巨噬细胞产生胞外陷阱,并初步探讨巨噬细胞胞外陷阱(METs)对其杀伤作用。本文通过荧光显微镜、菌落计数和免疫印记等技术分析单增李斯特菌侵袭的2种巨噬细胞胞外陷阱形态、产量及抑菌效果。结果显示,小鼠巨噬细胞系RAW 264.7以及人巨噬细胞系Thp-1均可在单增李斯特菌的诱导下产生胞外陷阱;Lm在侵袭巨噬细胞15min后已有METs产生,1~3h产量明显增大,然后随时间的推移逐渐减弱;METs可以有效抑制Lm的生长。另外,本试验还发现Lm诱导胞外陷阱的产生与细胞外信号调节激酶相关。

黄曲霉毒素B1诱导MEK/ERK/ROS介导的巨噬细胞自噬反应

为研究黄曲霉毒素B1(AFB1)能否诱导细胞自噬,并初步探讨其可能的作用机制。利用免疫荧光、酶标仪检测、免疫印迹等技术检测经AFB1处理过的细胞的自噬水平、相关蛋白的表达量以及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生情况。结果表明:AFB1能够引起RAW264.7细胞和Hela细胞的自噬反应,并且该自噬为完全自噬。AFB1诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7自噬是依赖细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)途径发生的,并受ROS的调节。此外,发现AFB1诱导ROS产生呈浓度依赖性,而ROS抑制剂同时抑制了ROS和自噬发生,但自噬抑制剂并没有有效地抑制ROS的产生,表明ROS处于AFB1诱导自噬的上游,对自噬起到调节作用。这表明AFB1诱导的自噬现象在细胞中普遍存在,而自噬作为机体的免疫机制,在抵抗AFB1毒力侵染的过程中发挥重要作用。

耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因的敲除对其生物被膜产量的影响

探索出一套分枝杆菌基因敲除的可靠方案,并研究耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因对其生物被膜产量的影响,结核分枝杆菌相关基因的敲除对其致病机理的深入研究有重要意义。利用融合PCR方法将MSMEG_6935基因的上、下游基因以及替代目的基因的kan基因融合,并将产物克隆到温敏型穿梭质粒pPR27,再电转入耻垢分枝杆菌mc2155中,筛选获得MSMEG_6935基因缺失株mc2155-6935。进一步研究MSMEG_6935基因的敲除对细菌生长曲线和生物被膜产量的研究。成功构建了MSMEG_6935基因的缺失株,并研究证明耻垢分枝杆菌MSMEG_6935基因的缺失对耻垢分枝杆菌的生长曲线没有影响,但会对其生物被膜的产量产生较大影响。

PMA诱导Hela细胞ROS升高机制研究

目的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)升高是癌症转移的主要原因之一,ROS已成为一种新的抗癌靶点,但其形成机制尚未完全阐明。本研究以佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导Hela细胞ROS升高为模型,探讨Hela细胞ROS升高的相关机制。方法 500ng/mL的PMA诱导Hela细胞0.5h,荧光酶标仪检测Hela细胞经过PMA诱导后的ROS产量,蛋白质印迹法检测Hela细胞经过PMA诱导后的HIF-1α、Rac2和NOX2蛋白的表达量。结果 500ng/mL PMA诱导Hela细胞0.5、1、2和4h,与空白对照组比较,P值分别为<0.001、0.055、0.125和0.135,表明0.5h为PMA诱导Hela细胞ROS升高的最佳诱导条件。500ng/mL PMA诱导Hela细胞0.5h后,诱导组中HIF-1α、Rac2和NOX2蛋白条带灰度平均值分别为15 833.33±63.13、20 448.33±78.65和21 840.33±123.91,均高于空白组的9 853.33±124.13、9 782.00±93.62和10 638.33±106.57,均P<0.001,表明PMA诱导了HIF-1α、Rac2和NOX2蛋白的高表达。荧光酶标仪检测Hela细胞ROS结果显示,echinomycin组、NSC23766组和DPI组与PMA组比较,P值分别为<0.001、0.003和<0.001,表明HIF-1α、Rac2和NOX2抑制剂均抑制了Hela细胞中PMA诱导的ROS升高。蛋白质印迹法检测结果显示,空白组HIF-1α、Rac2和NOX2灰度平均值分别为13 571.00±287.68、10 495.67±253.72和17 403.33±162.87,PMA组分别为22 946.33±67.10、30 578.67±251.11和30 582.00±88.39,NSC23766组分别为22 629.67±445.26、3 919.00±41.68和22 618.67±161.51,echinomycin组分别为16 691.33±9.504、15 424.00±315.05和14 899.00±71.55,DPI组分别为22 970.00±714.88、30 120.33±555.05和5 787.00±12.29。echinomycin组与PMA组比较,均P<0.001,表明echinomycin抑制了PMA诱导的HIF-1α、Rac2和NOX2蛋白的高表达;NSC23766组与PMA组比较,P值分别为0.354、<0.001和<0.001,表明NSC23766抑制了PMA诱导的Rac2和NOX2蛋白的高表达,但没有抑制HIF-1α蛋白的高表达;DPI组与PMA组比较,P值分别为0.944、0.117和<0.001,表明DPI抑制了PMA诱导的NOX2蛋白的高表达,但没有抑制HIF-1α和Rac2蛋白的高表达。结论 PMA能引起Hela细胞ROS升高,该现象依赖HIF-1α/Rac2/NOX2途径。这可能为阐明与ROS升高相关的癌症转移分子机制、干预癌症转移的靶向治疗分子研究提供思路。

三氯生通过诱导巨噬细胞非mTOR途径自噬加强胞内菌杀伤

为了研究三氯生能否引起细胞自噬并探讨其可能的诱导通路,揭示三氯生作为抗菌药物的新作用机制,利用免疫荧光、菌落计数、免疫印迹等技术检测经三氯生处理过细胞的自噬水平、相关蛋白表达量的变化及杀菌能力的改变。结果表明:三氯生能引起Hela细胞和Raw264.7细胞的自噬,并且该自噬为完全自噬。三氯生诱导的小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬依赖的是胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)途径,而非经典的雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)途径。此外,三氯生通过该作用机制加强了巨噬细胞对胞内菌的杀伤作用。研究表明,三氯生诱导自噬的现象在细胞中普遍存在,自噬在对抗病原微生物中起到重要作用,诱导自噬是三氯生作为抗菌药物的新作用机制。

磷霉素抑制α-溶血素的分泌并抑制其导致的巨噬细胞炎性因子激活机制研究

为了探讨磷霉素(fosfomycin,FOM)有效抑制α-溶血素的活性,并抑制巨噬细胞相关炎性因子激活的作用机制,研究采用抗菌药物敏感试验、溶血试验、蛋白免疫印迹试验等来确定FOM的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并检测亚抑制浓度的FOM对金黄色葡萄球菌α-溶血素产生的影响,以及在FOM和金黄色葡萄球菌作用下细胞水平的相关通路蛋白及炎性蛋白的表达情况。结果表明:α-溶血素是金黄色葡萄球菌的主要致病毒素,而FOM能够显著地抑制α-溶血素的活性。说明FOM通过抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达,抑制了金黄色葡萄球菌引起的巨噬细胞炎性反应。

破骨细胞胞外陷阱在类风湿性关节炎致病机制中的作用

该文主要分析了破骨细胞(osteoclasts,OCs)释放胞外陷阱(extracellular traps,ETs)的机制。利用免疫荧光、扫描电镜及免疫印迹等技术探究经II型胶原(type II collagen,CII)和佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbolmyristate 13-acetate,PMA)分别处理的破骨细胞导致胞外陷阱形成机理。结果表明,CII和PMA均能够引起破骨细胞胞外陷阱的形成,PMA诱导产生的是NOX依赖性胞外陷阱,而CII诱导产生的是NOX非依赖性胞外陷阱;结果还表明,II型胶原和PMA均通过AKT激活调控胞外陷阱的形成。总之,CII和PMA均可诱导破骨细胞形成胞外陷阱,探究其产生机制可以为类风湿性关节炎的有效治疗奠定基础。

活性己糖相关化合物对硫酸头孢喹诺预防和治疗乳腺炎模型小鼠的增强作用

为了提高硫酸头孢喹诺对小鼠乳房炎模型的防治效果,试验通过小鼠乳腺炎模型研究活性己糖相关化合物(AHCC)对硫酸头孢喹诺杀菌活性的影响,制订了预防性试验和治疗性试验两种方案。预防试验即在建立小鼠乳腺炎模型前给小鼠灌服AHCC 7 d,模型建立后连续3 d肌肉注射硫酸头孢喹诺(5组);治疗试验即在建立小鼠乳腺炎模型后连续3 d同时灌服AHCC和肌肉注射硫酸头孢喹诺(5组)。设空白对照组(1组)、阴性对照组(2组)及只灌服AHCC和硫酸头孢喹诺的3组和4组。结果表明:预防试验和治疗试验中,与1组比较,3组和5组的CD4+T细胞和γ/δT细胞含量都能极显著增加(P<0.001),并且局部乳腺组织含菌量降低,乳腺组织结构恢复完整。对比两种方案发现,AHCC的预防效果远优于治疗效果。说明AHCC联合硫酸头孢喹诺对金黄色葡萄球菌引起的小鼠乳腺炎的预防具有非常好的增强作用。