长链非编码RNA(lncRNA)-MSTRG.22610.1对BHV-1体外复制影响的研究

本研究室前期将牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)感染牛肾细胞(MDBK),通过转录组测序筛选到了转录显著差异的长链非编码RNA-MSTRG.22610.1(lncRNA-MSTRG.22610.1),为了探究其在MDBK中对BHV-1复制的影响,本研究采用CCK-8法筛选对细胞无毒性的聚凝胺、嘌呤霉素的最佳浓度;将重组慢病毒r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和r ZHLV-U6-Zs Green1-puro(对照慢病毒)按照不同的MOI分别感染MDBK细胞,48 h后观察荧光,采用Image J软件检测并计算各慢病毒感染细胞后出现绿色荧光细胞的比率,出现绿色荧光细胞的比率达80%的细胞对应的MOI即为最佳MOI。筛选结果显示聚凝胺与嘌呤霉素的最佳工作浓度分别为5μg/mL及3μg/m L,慢病毒感染的最适MOI为80。将r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和对照慢病毒分别以最佳条件感染MDBK细胞并培养及传代,传至8~10代,每代均观察细胞形态及细胞中的绿色荧光,并通过RT-q PCR检测第6、8、10代细胞中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平,以构建并鉴定稳定表达lncRNA-MSTRG.22610.1的MDBK细胞系1T及对照细胞系1NC。结果显示,每代1T细胞、1NC细胞的状态均良好并均与阴性对照MDBK细胞的形态无差别,且每代1T及1NC细胞均出现绿色荧光。RT-q PCR结果显示,与1NC及阴性对照细胞相比,1T细胞系中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平极显著升高(P<0.0001)。表明获得了高水平表达lncRNA-MSTRG.22610.1却不影响细胞增殖的细胞系,且该细胞系的遗传稳定性较强。将BHV-110倍倍比稀释后分别感染传至10代的1T与1NC细胞,24 h后采用Reed-Muench法计算各组细胞中的病毒滴度。结果显示,1T、1NC及MB细胞(感染BHV-1的MDBK细胞)的病毒滴度分别为105.15 TCID50/0.1 m L、104.41TCID50/0.1 m L及104.58 TCID50/0.1 m L。与MB和1NC细胞相比,1T细胞中的病毒滴度显著升高(P<0.05),表明lnc RNA-MSTRG.22610.1表达后促进BHV-1在MDBK细胞中的复制。本研究为进一步探究lncRNA-MSTRG.22610.1促进病毒复制的分子机制及深入了解BHV-1感染的分子机制提供参考依据。

BVDV非结构蛋白NS4B的结构分析及其蛋白表达与鉴定

NS4B是牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的非结构蛋白,为研究BVDV在病毒侵染宿主细胞过程中的作用,对ns4b进行了结构分析、表达载体构建及蛋白表达。采用Prot-Param、TExpasy和SignalP-4.1等软件分析NS4B蛋白的氨基酸组成、疏水性和空间结构。根据Genebank上公布的BVDVns4b基因序列设计引物,利用PCR方法获得ns4b基因片段,连接到p3×Flag-CMV10表达载体上,构建重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,经双酶切与测序鉴定正确后,将p3×FlagCMV10-ns4b转染到HEK-293T细胞中,利用Western blot检测NS4B蛋白的表达。结果表明BVDV NS4B蛋白分子量为38.4 kDa,不存在信号肽,有49个磷酸化位点和6个糖基化位点,是一种主要由α-螺旋和无规则卷曲结构组成的疏水性稳定蛋白。成功构建了重组质粒p3×Flag-CMV10-ns4b,并且p3×Flag-CMV10-ns4b在HEK-293T细胞中成功表达,为今后研究NS4B蛋白在BVDV感染宿主细胞及其免疫逃逸机制奠定了基础。

牛源TAK1基因慢病毒载体构建及其在MDBK细胞中的表达

为了探究转化生长因子-β激活蛋白1(TAK1)在牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染中的作用,构建牛源TAK1基因慢病毒载体,筛选TAK1基因稳转过表达细胞株。根据GenBank中牛源TAK1基因序列(登录号:NM-001081595.1)设计引物,PCR扩增目的片段后插入载体中,构建pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒,将其导入293T细胞进行慢病毒包装及滴度测定。用包装好的慢病毒感染牛肾上皮细胞(MDBK),筛选过表达TAK1基因的稳转细胞株,通过荧光显微镜和免疫印迹试验(Western blot)进一步验证该基因的过表达。重组质粒双酶切与测序结果表明成功建立了pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒。慢病毒滴度测定结果显示,过表达TAK1基因组病毒滴度为1.0×108 TU/mL,空载体对照组病毒滴度为5.0×108 TU/mL。重组慢病毒以MOI 180转染MDBK细胞,荧光显微镜观察到明显的红色荧光,表明慢病毒质粒转染成功。Western blot结果显示,在相应分子量处检测到目的条带,进一步表明TAK1基因被表达。成功构建了pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒,并筛选出了过表达TAK1基因的MDBK稳转细胞株,为深入研究TAK1在BHV-1感染中机制的研究奠定基础。

生物工程专业综合性实验教学改革初探

实验教学是培养学生创新能力和实践能力的重要环节,实验教学体系改革对于培养创新型人才具有重要的作用和意义。为了提高实验教学质量和效果,将生物工程专业开设的细胞工程学、病毒学和免疫学3门理论上联系紧密的课程结合起来开设综合性实验,使实验的目的性更强,更具创新性,更符合学科发展的大趋势。

牛γ干扰素基因的表达及其多克隆抗体的制备

为了获得牛γ干扰素表达产物及其多克隆抗体,利用分子生物学软件分析GenBank公布的牛γ干扰素的氨基酸序列,针对这一基因序列设计了一对特异性引物,并从牛脾脏淋巴细胞提取基因组总RNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出IFN-γ基因,与pMD18-T载体连接后进行酶切、PCR扩增以及序列测定和分析,并将其连接到pQE-30原核表达载体中,命名为pQE30-IFN-γ,转化到大肠埃希菌x-LI Blue感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导表达,经纯化后免疫接种小鼠,用ELISA测定小鼠血清中抗体效价。结果表明,RT-PCR扩增到510 bp的片段,重组蛋白大小为22 ku,与预期大小相符。Western blot分析结果表明,重组蛋白能与His-tag的单克隆抗体反应,说明该蛋白具有良好的免疫活性。用ELISA测定小鼠血清的抗体效价均在1∶32 000以上,说明该蛋白免疫效果较好,为下一步研究干扰素的功能奠定了基础。

牛干扰素-γ基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Genebank中已发表的INF-γ蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从Con A活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛INF-γ蛋白基因,其大小为510 bp左右。将该基因克隆到pMD18-T载体中,测序结果与Genebank上发表的INF-γ基因序列进行比较,其同源性为99.8%。将该基因从重组pMD18T-IFN质粒中克隆到表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建真核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。

研究生导师团队建设与实验室管理模式的实践

随着研究生招生规模的不断扩大,研究生培养模式和实验室管理模式也提出新的挑战。该文阐述了传统研究生培养机制及存在的问题;提出了细胞生物学研究生导师团队建设的培养模式和导师团队建设背景下的实验室管理模式。为进一步提高研究生培养质量提供参考。

Caspase非依赖性细胞死亡的研究进展

细胞凋亡是一种生理性细胞死亡机制,它是由多基因调控的一种细胞的主动的自杀性过程。一般认为它是由蛋白酶caspases通过两种途径激活的。但是,近年来研究发现除caspases引起的细胞凋亡外,还有caspases非依赖性的细胞死亡形式存在,包括细胞的自我吞噬作用、细胞蛋白酶体的降解和线粒体途径。这些途径无论是在试验的条件下还是在生理或病理的情况下都可以观察到。目前认为凋亡诱导因子(AIF)在caspases非依赖性的细胞死亡中起关键作用。

牛瘤胃植物乳杆菌的分离鉴定与生物学特性分析

牛瘤胃中栖息着复杂多样的微生物,这些微生物种群一般会受饲粮、宿主基因型、健康状况、生活环境以及环境中的共生微生物之间的群体效应等的影响,进而又影响着饲料的利用率和牛群的健康,因此弄清牛瘤胃微生物群是十分必要的。利用厌养分离技术从成年牛瘤胃中分离出一株细菌,命名为Y-A-1。结合细菌形态学、生理生化特性和16Sr RNA序列同源性分析鉴定,结果表明Y-A-1菌株为植物乳杆菌。对该菌的生长特性包括最适生长温度、生长曲线、耐酸能力、耐盐等进行测定,结果表明菌株在30℃,pH 5.5~7.5范围内,盐离子浓度在7.5以下的环境中生长最好,该菌株的分离和生物特性研究对牛瘤胃微生物生存状态有了初步的了解,为进一步了解牛瘤胃微生物群奠定了一定的基础。

牛γ-干扰素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank发表的牛γ-干扰素基因设计1对特异性引物,从牛脾脏淋巴细胞提取基因组总RNA,采用反转录?聚合酶链式反应(reverse transcriptase-PCR,RT-PCR)技术扩增出IFN-γ基因,与pMD18-T载体连接后进行酶切、PCR鉴定及序列测定和分析,并将其连接到pQE-30原核表达载体中,命名为pQE30-IFN-γ,转化到大肠杆菌x-LI Blue感受态细胞,IPTG(1.0 mmol/L)37℃诱导表达。结果显示,对重组质粒进行PCR鉴定,扩增到510 bp片段,重组蛋白大小为22 ku,与预期大小相符;Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag单克隆抗体反应,为下一步研究干扰素的功能奠定了基础。

鸡白细胞介素18基因的克隆与原核表达

白介素18(IL-18)最早被称为干扰素诱导因子(interferon-γ-inducing factor,IGIF),是近年发现的一种重要的免疫调节因子。该实验根据Gen Bank中已公布的鸡IL-18的基因序列,设计并合成了一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出IL-18基因,并将该基因克隆到p MD18-T载体中,经过质粒酶切、PCR和测序鉴定,阳性克隆命名为Chp MD18-T-IL-18。将Chp MD18-T-IL-18双酶切后与p ET32a表达载体连接,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达鸡IL-18蛋白,结果表明,在28k D左右出现了目的条带,经west-ern blot检测确定该蛋白获得高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

鸡传染性支气管炎病毒S2蛋白基因的克隆与序列分析

参考genebank已发表的IBV纤突蛋白S2基因序列,设计了两对特异性引物,对鸡传染性支气管炎病毒黑龙江肾型分离株Mg/Mk和K进行RT-PCR扩增,将扩增后得到的PCR产物克隆入pMD18-T载体,并进行测序和分析。结果显示:S2基因的核苷酸全长为1884bp,编码一条由628个氨基酸组成的多肽,与网上报道的相一致。地方分离株Mg株、Mk株、K株分别和标准株T株比较,其同源性分别为92.3%、94.7%和94.2%。而Mg和Mk株的同源性为97.2%,Mg和K株的同源性为96.7%,Mk和K株的同源性为99.5%。说明地方分离株的亲缘关系较近,而和T株的亲缘关系较远。

盐酸小檗碱对小鼠脾细胞增殖和凋亡及分泌细胞因子的影响

目的研究盐酸小檗碱(BBR)对小鼠脾细胞增殖与凋亡及细胞因子产生的影响。方法采用无菌取BALB/c小鼠脾脏,制成脾细胞悬液,脾细胞预先用(1、2、4)μg/mL BBR处理60 min,加入刀豆蛋白(ConA)刺激脾细胞增殖,细胞培养至24、48、72 h时,用MTT方法检测脾细胞增殖情况;流式细胞术检测脾细胞培养不同时间的凋亡情况,用细胞因子ELISA检测试剂盒定量分析细胞上清液中TNF-α,IL-2和IFN-γ的浓度。结果与对照组相比,在以上浓度范围内,BBR对ConA刺激下实验组小鼠脾细胞的增殖和TNF-α,IL-2,IFN-γ产生有明显的抑制作用(P<0.05),且呈浓度及时间依赖性,但对小鼠脾细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。结论 BBR对小鼠脾细胞具有明显的免疫抑制作用,可作为潜在的免疫抑制药物。

肝片形吸虫重组谷胱甘肽-S-转移酶对SD大鼠的免疫原性分析

目的分析肝片形吸虫重组谷胱甘肽-S-转移酶(FhGST)对SD大鼠的免疫原性。方法将已构建重组原核表达质粒pET30a-FhGST转化大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌,以异丙基-β-D-硫代半乳精苷(IPTG)诱导重组蛋白表达十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫反应性。20只SD大鼠随机均分为蛋白免疫组和佐剂对照组,蛋白免疫组以纯化的重组蛋白皮下注射免疫Sd大鼠,抗原免疫剂量为200μg/(只·次),共免疫3次,每次间隔3周。佐剂对照组以PBS代替免疫抗原同法注射。免疫前、每次免疫后和末次免疫后3周、6周鼠尾采血,分离血清。利用间接ELISA法检测免疫大鼠血清IgG抗体水平的动态变化,噻唑兰法(MTT法)检测脾淋巴细胞增殖情况。结果经纯化获得重组FhGST蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示,在相对分子质量M_r 31300处出现单一条带。Western blotting分析结果表明,纯化重组FhGST蛋白能识别自然感然肝片形吸虫的山羊阳性血清,在M_r 31 300处可见特异的免疫反应带。重组FhGST蛋白免疫SD大鼠后,可诱导产生特异性IgG抗体,在免疫后第9周,抗体效价达到顶峰(1:89 144),且明显高于佐剂对照组(1:1000)重组蛋白能显著刺激大鼠脾细胞的生长和增殖。结论重组FhGST蛋白能诱导SD大鼠产生特异性免疫应答,具有良好的免疫原性。

研究性教学模式下遗传学教学的改革与实践

研究性教学是培养学生创新精神、提高学生研究能力的有效方式。笔者根据在黑龙江八一农垦大学十多年的遗传学教学经验,对本科生进行了遗传学研究性教学的改革与实践。文章概括了遗传学研究性教学模式,并且提出遗传学教学改革应该努力培养创新型人才,不断进行教学梯队建设,优化教学条件,加强教学效果,可以更好地提高学生的创造性和学习的主动性,开拓学生的视野,为培养创新性人才奠定良好的基础。

肝片吸虫组织蛋白酶L真核表达载体构建及重组蛋白活性分析

目的构建肝片吸虫组织蛋白酶L(CatL)的真核表达载体,研究重组蛋白的生物学活性。方法以构建好的重组质粒pET30a-FhCatL为模板,利用PCR技术扩增肝片吸虫组织蛋白酶L基因(catL),连接真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-CatL,转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,Western blotting检测重组蛋白表达情况。结果重组质粒pEGFP-N1-CatL在HeLa细胞中获得了表达,Western blotting结果表明真核表达质粒表达的重组蛋白能与自然感染肝片吸虫的山羊阳性血清发生特异性反应。结论肝片吸虫CatL真核表达载体构建成功,真核表达产物可与自然感染的山羊阳性血清发生特异性反应,具有免疫反应性,可做为分子疫苗的候选和诊断抗原进行进一步的研究。

新城疫病毒Ⅰ系毒株通过Caspase途径诱导鸡胚成纤维细胞凋亡

应用不同Caspases抑制剂研究了新城疫病毒(NDV)Ⅰ系毒株诱导鸡胚成纤维细胞(CEF)凋亡的途径。结果,用20μmol/L的Z-VAD.fmk、Z-IETD.fmk和Z-LEHD.fmk分别处理CEF后,均能抑制NDVⅠ系毒株诱导的CEF凋亡;而用20μmol/L的Z-DEVD.fmk和Z-AEVD.fmk分别处理CEF,则不能抑制NDVⅠ系毒株诱导的CEF凋亡。由此表明,NDVⅠ系毒株能通过Caspase依赖性途径诱导CEF凋亡,其中Caspase-8和Caspase-9在凋亡中发挥重要作用,而Caspase-3和Caspase-10在凋亡中不发挥作用。

重组大肠杆菌外膜蛋白OmpT对小鼠免疫保护作用的研究

为评价大肠杆菌(E.coli)外膜蛋白酶T(OmpT)的免疫原性及对小鼠的免疫效率,本研究将原核重组表达纯化的OmpT蛋白(rOmpT)免疫小鼠,并以灭活的E.coli 308-2全菌疫苗株作为对照组,通过检测其抗体效价、体外调理吞噬作用和细胞因子表达水平以及攻毒试验进行保护效率评价。结果表明rOmpT免疫组在二免后14 d其抗体水平可以达到峰值(1∶64 000),并且其抗血清具有显著促进巨噬细胞对E.coli的吞噬作用;同时,重组蛋白与全菌免疫组均能够显著提高小鼠体内IL-4和IFN-γ的表达。而且重组蛋白免疫组对4个进化种系(Phylogenetic group)的E.coli攻毒的免疫保护率均为60%左右,比全菌免疫组高约10%。研究结果显示rOmpT比全菌灭活E.coli能够诱导小鼠产生更有效免疫保护作用,表明rOmpT可以作为E.coli亚单位疫苗候选蛋白。

不同凝固酶基因型牛源金黄色葡萄球菌主要致病因子的检测及分析

采用PCR的方法对不同凝固酶基因型的30株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的主要致病因子进行检测,包括α溶血素(α-hemolysin)、β溶血素(β-hemolysin)、白细胞毒素F(LukF)、白细胞毒素S(LukS),结果显示:在28株分离株中检测到LukF和LukS;在8株和3株分离株中检测到β、和α溶血素,其分别占分离株的93%、26.7%和10%。这些致病因子在各基因型菌株间的分布并不表现出相关性,而是广泛的分布在各个基因型菌株间。