盐霉素体外对猪流行性腹泻病毒的抑制效果

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病,给全球养猪业造成巨大的经济损失,但目前仍无有效的疫苗和治疗药物。盐霉素(salinomycin, SLM)是一种常用的抗生素,具有不易产生耐药性、排泄迅速、残留量极低的优点。为明确SLM对PEDV的抑制作用,首先通过TCID_(50)(tissue culture infective dose)检测PEDV在Vero细胞上的增殖规律,进一步经CCK-8试验和细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)测定SLM的半数细胞毒性浓度(half-cytotoxic concentration, CC_(50))和其对PEDV的半数抑制浓度(median inhibition concentration, IC_(50)),最后建立SLM、PEDV和Vero细胞的作用模型,利用RT-qPCR、免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay, IFA)技术检测SLM对PEDV复制周期的影响。结果表明PEDV感染Vero细胞后24 h病毒滴度最高(10^(7.7)·0.1 mL^(-1));SLM对Vero细胞的CC_(50)为7.698μmol·L^(-1),对PEDV的IC_(50)为1.617μmol·L^(-1);随着SLM浓度的增加,PEDV滴度、N蛋白和N基因mRNA的表达量逐渐下降;SLM抑制PEDV的复制阶段,对病毒的吸附、入侵和释放阶段无明显影响。该研究结果可以为进一步挖掘PEDV抑制药物提供新思路。

昆虫杆状病毒表达的猪圆环病毒2d型Cap蛋白-VLP对仔猪的免疫保护效果

猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组装为VLP的PCV2d-Cap蛋白,然后将9头21日龄健康仔猪随机分为VLP组、攻毒对照组和空白对照组(n=3)。VLP组的每头仔猪经颈部肌肉注射400μg Cap蛋白-佐剂复合物(PCV2d-VLP),攻毒组注射等体积的PBS与佐剂混合物,空白组注射等体积的PBS。共接种2次,每次间隔14 d。于第2次免疫后21 d,VLP组和攻毒对照组的仔猪通过鼻腔感染PCV2 HBDX-2018株(106TCID50/头),评价PCV2d-VLP诱导的免疫效果。结果表明PCV2d-VLP能够诱导仔猪产生高水平的特异性IgG抗体和中和抗体,刺激IFN-γ水平升高,引起外周血淋巴细胞增殖能力增强,降低病毒经鼻腔和直肠的排毒率及病毒血症阳性率,减轻腹股沟淋巴结和脾脏的病理损伤,降低组织中的病毒载量。上述研究表明,应用杆状病毒表达的PCV2d-Cap蛋白能自组装为VLP,并能诱导仔猪产生良好的免疫保护效应,具有进一步开发为PCV2d-VLP疫苗的潜力。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。

鸡γ-干扰素的原核表达及其单克隆抗体制备与鉴定

【目的】通过原核表达系统表达鸡γ-干扰素(chicken interferon-gamma,ChIFN-γ),并制备其单克隆抗体,为建立检测天然ChIFN-γ的免疫学方法提供试验材料。【方法】将密码子优化的ChIFN-γ基因克隆至原核表达载体pET-21a(+)中,构建重组质粒pET21a-ChIFN-γ;重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,利用IPTG诱导表达重组蛋白;用该纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫合格的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合;用建立的ELISA方法筛选分泌针对ChIFN-γ蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞,并制备腹水,Protein A/G纯化腹水获得特异性抗体;对单克隆抗体的类和亚类进行鉴定;Western blotting和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测单克隆抗体的反应性、亲和力和特异性交叉反应;用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体,用两两配对的方法进行抗体配对。【结果】成功制备可溶性重组ChIFN-γ蛋白;Western blotting结果显示,ChIFN-γ与相应抗体结合呈现特异性条带(16 ku);获得7株针对ChIFN-γ的特异性杂交瘤细胞株:3E8、5F8、2G12、5A10、3D8、3B5、3G2。Western blotting和IFA结果显示,7株单克隆抗体反应性良好,均能特异性识别真核表达的ChIFN-γ;单克隆抗体的类和亚类鉴定结果显示,3E8、5F8、3D8、3B5和2G12重链均为IgG1,5A10重链为IgG2a,3G2重链为IgM,7株单克隆抗体的轻链均为Kappa型;所获得的7株单克隆抗体解离常数(dissociation constant,Kd)在1.04~58.33 nmol/L之间,为高亲和力抗体,并获得5组配对抗体。【结论】本研究成功制备了ChIFN-γ蛋白及其单克隆抗体,为进一步开展ChIFN-γ在禽类免疫学、病毒学及疫苗效果评价等相关研究奠定基础。

莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物菌群结构组成和功能分析

旨在研究莱芜猪盲肠和结肠肠道微生物群落的结构组成、功能以及与杜长大猪的区别,为从肠道菌群层面深入理解莱芜猪高脂肪沉积、耐粗饲和抗逆等特性奠定基础。以12头莱芜猪和6头杜长大猪为试验动物,采用高通量测序技术测定盲肠和结肠微生物菌群16S rRNA V3-V4区序列,分析微生物菌群的组成、丰度和多样性,预测生物功能,通过对莱芜猪和杜长大猪菌群丰度比较分析、LEfSe物种差异判别分析、微生物菌属与背膘厚和血清生化指标相关性分析,鉴定影响莱芜猪品种特性的微生物菌属。结果发现:1)莱芜猪的背膘厚和血清总蛋白、甘油三酯、葡萄糖、高密度脂蛋白胆固醇等指标与杜长大猪存在显著性差异(P<0.05)。2)莱芜猪具有与杜长大猪不同的盲肠和结肠微生物菌群多样性和相对丰度,莱芜猪盲肠微生物菌群的Simpson指数显著高于杜长大猪(P<0.05),盲肠的厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度显著低于杜长大猪(69.16%vs.89.59%,P<0.05)。3)盲肠和结肠中一些微生物菌属的丰度与背膘厚和部分血清生化指标具有显著相关性(P<0.05),且与这些表型指标相关的盲肠微生物菌属比结肠更多,相关系数也更高,表明盲肠微生物菌群对猪的表型起到了更大的作用。4)甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)和大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、活泼瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)、拟杆菌属(Bacteroides)等与脂肪沉积、耐粗饲和抗逆性强等有关,可能是影响莱芜猪特性的微生物菌属。本研究阐述了莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物菌群特征,加深了肠道菌群对莱芜猪品种特性影响机理的了解,为地方猪肠道微生物资源的开发与利用奠定基础。

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白单克隆抗体,为ASFV检测方法的研究提供重要试验材料。【方法】应用大肠杆菌表达重组ASFV p30蛋白,并用该蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,应用细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合;通过间接ELISA方法筛选分泌p30蛋白特异性抗体的阳性杂交瘤细胞,腹腔接种小鼠制备腹水抗体;应用ELISA方法鉴定单克隆抗体的类/亚类,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定单克隆抗体与p30-N端(1―105位氨基酸)和p30-C端(100―194位氨基酸)区域的反应活性;针对抗体识别的p30蛋白区域合成不同肽段,通过ELISA和斑点免疫印迹法鉴定抗体识别的抗原表位。应用间接ELISA方法分析单克隆抗体与ASFV p72蛋白、猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳(Cap)蛋白、猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的交叉反应性,以及ASFV抗血清对单克隆抗体抗原结合活性的阻断作用。【结果】获得了2株杂交瘤细胞(C7和G10),其分泌的单克隆抗体(C7和G10)都属于IgG1亚类和κ型(IgG1κ),杂交瘤细胞培养上清和腹水内C7和G10的抗体效价分别为1∶1280、1∶640与1∶10^(7)、1∶10^(6);2株抗体均与p30-C端(100―194位氨基酸)区域特异性结合,并识别同一个抗原表位115 CTSSFETLFEQEPSSEVPKD^(134);2株抗体与ASFV p72蛋白、PCV2 Cap蛋白及PEDV S蛋白无交叉反应;ASFV抗血清能有效阻断2株单克隆抗体与p30蛋白结合。【结论】获得2株分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,鉴定了单克隆抗体的抗原识别表位,丰富了p30蛋白的抗原表位信息,为ASFV致病机制的进一步研究提供支撑。

非洲猪瘟病毒可视化重组酶辅助扩增检测方法的建立与初步应用

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)重组酶辅助扩增(RAA)与核酸检测试纸条相结合的可视化RAA检测方法,本试验根据ASFV的B646L基因(编码p72蛋白)保守区设计特异性的引物和探针,通过优化引物和探针浓度、反应温度和反应时间,确定反应的最佳体系和扩增条件;检测建立的可视化RAA方法的特异性和灵敏性,分析建立方法与非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒对临床样品检测结果的符合率。结果显示,建立的可视化RAA方法的反应体系为25μL,在38℃恒温条件下反应20 min即可在5 min内读取结果;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等均不发生交叉反应;单个反应可检测到48.75拷贝的病毒核酸。初步临床应用结果显示,建立的可视化RAA方法与商品化的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒检测结果一致,其阴性和阳性符合率均为100%。本试验成功建立的基于ASFV B646L基因的可视化恒温扩增方法具有反应时间短、特异性和灵敏度高、操作便捷等优势,适合现场快速检测和诊断,具有进一步开发潜力。

京津冀地区猪圆环病毒3型的全基因组克隆与分析

【目的】监测近期在京津冀地区流行的猪圆环病毒3型毒株及其基因变异情况。【方法】以近期京津冀地区猪圆环病毒3型阳性临床样品为模板,用PCR技术扩增猪圆环病毒3型全基因组片段,随后进行基因克隆、序列测定和序列分析。【结果】PCR扩增、序列测定和BLAST比对结果显示获得4株大小都为2000个核苷酸的猪圆环病毒3型全基因组序列。基于全基因组核苷酸分析结果显示,这4株猪圆环病毒3型与选取的国内外15株猪圆环病毒3型的同源性均达98.4%以上,系统发育树显示上述PCV3毒株所处的分支虽有所不同但却都非常近,表明不同猪圆环病毒3型毒株之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性和保守性。基于开放阅读框2基因核苷酸的系统发育树显示上述猪圆环病毒3型毒株被分成3个分支,所得4株猪圆环病毒3型分别归属于基因型a与c,并呈现出一定的地域差异。【结论】获得了京津冀地区4株猪圆环病毒3型全基因组序列,虽然它们具有很高的全基因组核苷酸同源性与保守性,但却分属于2种基因型,并呈现出一定的地域差异。

猪GM-CSF基因对猪圆环病毒2型DNA疫苗诱导仔猪免疫反应的调节作用

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)能够诱导树突状细胞的成熟和存活,并提高其抗原递呈功能,是非常有潜力的分子佐剂之一。为了探讨猪GM-CSF对猪圆环病毒2型(PCV2)DNA疫苗诱导免疫反应的调节作用,本研究将表达猪GM-CSF和PCV2衣壳蛋白的重组质粒混合物(pcDNA3.1-gm-csf和pcDNA3.1-orf2)及在同一载体上表达PCV2衣壳蛋白与猪GM-CSF的双表达重组质粒(pIRES-orf2/gm-csf),分别接种于7日龄健康仔猪,共肌肉注射3次,每次间隔2周。结果表明猪GM-CSF基因能够明显增强PCV2DNA疫苗诱导的特异性体液免疫反应,提高外周血淋巴细胞(PBLC)对ConA刺激的增殖活性,增强NK细胞的杀伤功能,影响细胞因子IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平。但GM-CSF基因单独表达和与PCV2衣壳蛋白基因在同一载体上表达,对上述4个细胞因子表达的影响有一定差异。

18种抗菌药物对绵羊肺炎支原体和丝状支原体分离株的抗菌活性

应用微量法测定了18种常用抗菌药物对绵羊肺炎支原体分离株HD1-goat和丝状支原体分离株XT1-goat的抗菌活性。结果表明,喹诺酮类药物及盐酸多西环素、酒石酸泰乐菌素对两个分离株均有很高的抗菌活性;硫氰酸红霉素对分离株HD1-goat无抑制生长作用,但对分离株XT1-goat有很高的抑制和杀灭活性;氨基糖苷类药物和磺胺甲噁唑对两个分离株均无抑制作用;分离株HD1-goat对盐酸林可霉素、土霉素、延胡索酸泰妙菌素和氟苯尼考等常用抗菌药物的敏感性降低。上述结果提示,喹诺酮类药物及盐酸多西环素、酒石酸泰乐菌素是当前治疗羊传染性胸膜肺炎的敏感药物,不同支原体分离株对同一种抗菌药物的敏感性有差异,有的绵羊肺炎支原体分离株对临床常用抗菌药物已显示耐药趋势。

鸡毒支原体油乳剂灭活苗对降低鸡毒支原体垂直传播作用的研究

本试验将 30只MG阴性的 2 0周龄的蛋种鸡随机分为 4组 ,Ⅰ组于 2 1和 2 5周龄、Ⅱ组仅于 2 5周龄时分别颈部皮下接种MG油乳剂灭活苗 0 5ml/只 ,Ⅲ组于攻毒后 1周接种 1ml/只 ,另设一组对照 ,不接种疫苗。各组均在 2 9周龄时用通过SPF鸡两次复壮的MG BG4 4T株经左胸气囊和鼻腔攻毒。收集攻毒后 1～ 7周内所产的蛋 ,用PCR方法检测鸡蛋卵黄膜中的MG。结果在攻毒后 7周内各免疫组 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ )的垂直传播率显著低于对照组 (P<0 .0 1) ,分别比对照组低 2 6 37%、12 8%、13 6 4 %。攻毒后各免疫组和对照组经 4次采样均可从喉头拭子中分离到MG但免疫组的分离率较低。攻毒后第 7周从对照组鸡的气管、肺、气囊中均可分离到MG ,而试验Ⅰ组仅在气管和肺中分离到了MG。试验Ⅰ组和对照组鸡的输卵管、心、肝、脾和肾中均未分离到MG。

猪圆环病毒2型河北分离株的基因型鉴定及其毒力分析

为了明确河北部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的基因型及其毒力,应用免疫过氧化物酶单层实验(IP-MA)对从保定、唐山和衡水分离的3株PCV2进行了鉴定,分别命名为PCV2-BD1A、TSh1和HSh1。以PCV2 Cap基因为靶基因,运用PCR-RFLP技术对3个分离株进行了基因型鉴定,结果分离株BD1A和TSh1为2H基因型,分离株HSh1为2I基因型,提示2H基因型仍然是当前河北地区PCV2流行毒株的优势基因型。通过与已知PCV2强毒株(PCV2-40895)Cap蛋白的氨基酸序列比较分析,推测PCV2-BD1A、TSh1和HSh1 3个分离株均为强毒力PCV2。

混合感染中鸡毒支原体和副鸡嗜血杆菌的分离鉴定

从冀南地区某养鸡场患呼吸道疾病的病鸡群采集 5份样品 (气管和眶下窦分泌物 )中 ,同时分离到鸡毒支原体和副鸡嗜血杆菌两种病原体。通过病原的分离培养、细菌L型检验、生化试验、血清学试验等鉴定 ,证明分离的鸡毒支原体与国际标准株S6的血清型一致 ,副鸡嗜血杆菌的血清型为A型。动物试验表明 ,分离的鸡毒支原体和副鸡嗜血杆菌均具有明显的致病性 。

核酸疫苗研究进展

核酸疫苗 (DNA疫苗 )是 2 0世纪 90年代诞生的一种新型疫苗 ,具有能够激发机体全面免疫反应、不散毒、便于储存和运输等优点。抗原递呈细胞在 DNA疫苗诱导产生的 CTL反应中起主导作用。 DNA疫苗的运输载体 (脂质体、减毒突变的胞内菌等 )、佐剂 (细胞因子等 )以及疫苗接种方法和途径等因素可以提高和改变 DNA疫苗的免疫效果与反应类型。 DNA疫苗自诞生以来 ,其安全性一直是人们关心的问题 ,也是 DNA疫苗得以日后应用于临床的关键。

某规模化猪场大肠埃希菌O141的分离鉴定及药敏试验

从河北衡水某规模化猪场21日龄发病仔猪脾脏中分离到1株革兰氏阴性杆菌,通过菌落形态、培养特性和微量生化试验,鉴定为大肠埃希菌,应用大肠埃希菌O抗原定型血清鉴定为O141。该菌株对供试的14种抗菌药物均产生耐药性,其中多种常用抗菌药物对其完全没有抑制作用。动物致病性和毒素试验表明,该菌株在20 h内能够导致70%小鼠死亡,并产生热稳定肠毒素,为1株产肠毒素性大肠埃希菌。

稳定表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白P815细胞系的建立

应用脂质体介导的基因转染方法,将表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus,PCV2)衣壳蛋白的重组质粒pcDNA3.1-orf2转染P815细胞,筛选G418抗性单克隆细胞,并经PCR、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,随后对目的蛋白表达稳定性进行了检测。结果表明PCV2orf2基因已经整合进P815细胞基因组DNA中,ORF2编码的衣壳蛋白在获得的阳性P815细胞中稳定表达,建立了稳定表达PCV2衣壳蛋白的P815细胞系。该细胞系的建立为PCV2新型疫苗的研究提供了必要的实验材料,同时也可为其他病毒疫苗的研究提供有价值的参考。