表达非洲猪瘟病毒p72蛋白重组猪痘病毒的构建及鉴定

【目的】旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,为探索猪痘病毒(SPV)作为非洲猪瘟新型活疫苗载体的可行性。【方法】本研究优化合成非洲猪瘟病毒B646L基因,克隆至重组猪痘病毒通用转移载体pUSG11/P28,构建重组转移质粒pUSG11/P28-B646L,经脂质体介导转染预先感染猪痘病毒的PK15细胞,出现病变后通过绿色荧光标记筛选和纯化重组病毒。拯救的重组病毒经PCR和基因测序鉴定后,通过Western blotting和间接免疫荧光试验检测p72蛋白的表达情况,并测定重组病毒的增殖特性和遗传稳定性。【结果】重组转移质粒pUSG11/P28-B646L在PK15细胞内和SPV成功进行了同源重组,纯化得到的重组病毒含有B646L基因,且基因序列正确。Western blotting和间接免疫荧光试验结果表明,重组病毒rSPV-B646L在PK15细胞中能表达非洲猪瘟病毒p72蛋白,表达的蛋白大小正确,且能与p72单克隆抗体发生特异性反应。一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性没有明显差异。重组病毒在PK15细胞上连续传15代后,插入的外源基因没有发生突变或缺失。【结论】研究以SPV为载体,成功构建了正确表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,重组病毒在PK15细胞中有良好的遗传稳定性,B646L基因的插入没有影响重组病毒在PK15细胞上的增殖能力,表达的p72蛋白具有反应原性。研究成果为非洲猪瘟多基因重组猪痘病毒载体疫苗的研发提供依据。

新农科背景下大学生创新创业能力培养模式探索

围绕乡村振兴战略和新农科建设对创新人才的需求,聚焦动物医学专业人才创新创业能力培养存在的问题,以培养学生创新创业意识和能力、科研能力、社会实践能力为导向,通过“专业课程学习与科研训练、创新创业课程与创新竞赛、校内外实践基地与行业企业实践”相互融合与协同互动,形成了“创新竞赛、科研训练、社会实践”三位一体的动物医学专业人才创新创业能力培养模式。实践证明,该模式可有效助推动物医学专业人才创新创业能力培育,实现其培育质量的显著提升。

生命信息安全控制太极经纬图解构

基于前期危险因子与生命机体机制信息相关互动图,探索危险因子与生命机体机制信息间所属功能位置关系和内在联系,将该互动图从二维形式提升到三维形式,构建出生命信息安全控制太极经纬图。该图由5个太极纬平面和1个垂直贯穿太极纬平面的生命信息安全控制轴组成,控制轴与太极纬平面间构成虚与实、经与纬关系,形成“致虚极,守静笃”的动态平衡局面。5个太极纬平面分别代表模式识别受体识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式、NK细胞活化受体识别机制、特异性识别系统机制、正负反馈性调控机制以及黏膜、皮肤与共生微生物相互联系机制。由太极纬平面间内在功能联系分析:第1、2太极纬平面机制处在整个系统最前沿位置,应对危险原发生第一响应,把危险原信息传递给第3太极纬平面;第3太极纬平面接受危险原信息,发生第二响应,处在“后援位置”;第4太极纬平面针对信息应答过度或不足作适时调整,作正、负反馈性功效,在整体系统中处于极其重要效应作用地位;第5太极纬平面机制是整个系统的基盘,特别是黏膜系统,该安全控制系统重点布局集中在此,体现在功能力量对比中巨量共生微生物客观存在决定其重要作用地位。由太极经纬图显示,NK细胞活化受体-配体关系中的配体归入该系统范畴中。首次提出“危险原”概念,涵盖抗原、病原体相关分子模式、损伤相关分子模式和NK细胞活化受体-配体(变应信息)的配体。还推出NK细胞功能效应机制原理假说:以物种整体遗传信息为背景,构筑决定攻击与否防控性配套受体-配体关系,推测细胞基因组中存在表达代表自身身份信息配体的基因家族和表达报告变应信息配体的基因家族。上述构建的太极经纬图显示出生命信息安全控制机制的整体构象。

副猪嗜血杆菌江西分离株药物敏感性及四环素耐药基因tet(B)分析

为了解副猪嗜血杆菌江西株的药物敏感性及其耐药基因,本实验采用K-B法测定分离株对57种药物的敏感性,结果显示20株副猪嗜血杆菌均对阿洛西林和万古霉素敏感,80%及以上的分离株对氨苄西林\舒巴坦、阿莫西林\棒酸等高度敏感。但分离株对恩诺沙星、氨曲南、四环素等的耐受性较强,某些菌株对多种药物具有抗性,其中6株菌能够耐受5种药物,5株菌能够耐受12种药物,3株菌能够耐受13种药物,甚至有2株菌能够耐受多达22种药物。将江西分离株的药物敏感性结果与其它国家或地区以及不同时间分离菌株的结果相比较表明,不同地区及不同时间段分离的菌株药物敏感性存在较大差异。为探索副猪嗜血杆菌耐药的分子机制,本研究设计引物并建立了检测四环素耐药基因tet(B)的PCR方法。运用所建立的方法检测江西株tet(B)基因,在15株四环素耐药菌株中检测出其中9株菌存在该基因,推测tet(B)可能是介导该菌对四环素耐药的主要分子机制之一。

智能化农机装备在水稻生产上的应用

近年来,随着时代的进步与发展,我国农业不断趋于现代化、科技化,提升了农业种植的效率。在水稻种植过程中,采用现代化的创新技术,加强对生产方式的创新,有效提升了水稻生产效果,很大程度上实现了机械化种植生产。智能化农机装备不仅可以有效地缓解劳动力紧缺的情况,还能通过使用现代化先进的插秧设备、播种设备,提升生产效率,实现高质量作业,为水稻种植全智能化、自动化奠定基础。文章从水稻种植不同环节中智能化农机装备应用的情况进行分析,针对存在的问题和现状提出优化对策,促进智能化农机装备的普及和应用,为农业可持续发展奠定基础。

玉米高产创建栽培技术研究进展

从现阶段玉米种植与栽培成效上来看,玉米高产创建栽培技术属于近几年玉米研究的重点。在实现玉米品种优化的基础上,提高玉米的环境适应能力、病虫害抵抗能力,并优化玉米的总产量。而玉米高产创建栽培技术在具体的推进当中,能够对各项栽培技术、栽培方案进行调节与管控,实现农机技术与农艺技术全方位融合的基础上落实高产栽培,由此要对这部分内容展开研究,为区域间农业生产提供优质助力。

副猪嗜血杆菌江西株的分离鉴定及生物学特性研究

为调查江西省副猪嗜血杆菌的感染情况,从而为江西副猪嗜血杆菌病的防冶提供基础。从江西省32个规模化养猪场的80份表现纤维素性炎症的病料中分离得到了20株革兰氏阴性杆菌,经细菌形态、生化反应及PCR鉴定。结果表明分离菌为副猪嗜血杆菌,16S rRNA序列与NCBI上公布的序列同源性在97%左右。生物学特性研究表明,该菌只能在含血清和辅酶(NAD)的营养丰富的培养基上能生长,在不同的保存条件下该菌的存活时间差异很大。

江西省多个猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

笔者于2008年11月至2009年2月,从江西省多个猪场的以多发性纤维素性浆膜炎为特征的病猪采集肺脏、关节液、脑组织等病料,接种于TSA平板及巧克力平板,分离到4株革兰氏阴性细小杆菌,兼性厌氧,经生化试验及PCR检测确定均为副猪嗜血杆菌。其中一代表菌株的药敏试验结果表明,其对环丙沙星等药物高度敏感,对新生霉素等药物中度敏感,对庆大霉素等药物不敏感。

仔猪副伤寒的病原分离鉴定

为对初诊为患仔猪副伤寒的仔猪进行病原分离鉴定,本试验采集其病料进行病原分离,经镜检和生化鉴定证实引起该病的病原为猪伤寒沙门氏菌。药敏试验结果显示,分离菌株的耐药性非常强,除呋喃妥因、头孢唑林、强力霉素等对该菌株有一定的作用外,其它大部分常用抗生素对该分离菌株均没有作用;毒力试验结果表明,该菌株的毒力很强,进一步说明引起仔猪发病的病原是猪伤寒沙门氏菌。

一株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物敏感性分析

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis , Hps）是格拉泽氏病（Glasser’s diseases）的病原，是猪上呼吸道常在菌，在机体遭受应激或感染病毒性疾病（高致病性猪蓝耳病、圆环病毒病、猪瘟等）导致免疫力下降时可以侵入机体引起发病。

生命信息安全控制原理的再探讨

建立生命信息安全控制原理的理论性平台,由该平台的视野分析免疫学所涉及的诸多理论问题,譬如免疫记忆、免疫功能等方面,并针对性进行归纳以及绘制出相关图形,试图将免疫学理论中所呈现的纷繁复杂性的方面以及过于分散的条块更加条理化、清晰化及整体化。由逻辑学的层面讨论免疫学学名的形成,分析结果:免疫学学名应归结为主观是非逻辑意识产物,并主张认识论应回归自然生成逻辑的观点。免疫记忆在本质上是对遗传信息的记忆,离开了遗传信息的识别与分析就不存在免疫记忆。众多学者的系列研究资料表明,CD4+T细胞在CD8+T细胞反应的起始就辅助其发挥作用,并维持其记忆细胞功能,而CD4+T细胞的记忆是由TCR-MHCⅡ信号所决定。X线晶体衍射及三维结构图所显示MHCII类肽结合凹槽内的多肽更能显示出呈递多肽遗传信息的功能,而MHCI类分子肽结合凹槽内的多肽难以与呈递多肽遗传信息的功能联系起来。只有辅助性T细胞是决定与辅助记忆的细胞,其不仅决定B细胞胸腺依赖性抗原的记忆,而且决定CD8+T细胞的记忆性。对生命信息识别从记忆属性层面进行分类,即分为遗传信息密码识别(记忆属性)和非遗传信息密码识别(非记忆属性)2大类。通过危险因素、生命信息感应器、信息识别及应答调控这样4个相连贯环节的分析,绘制出生命信息安全控制原理图。从功能效应层面进行讨论,将生命信息安全控制的功效分类为正面功能效应和负面功能效应2大类,其中将组织修复归结为正面功能效应,创伤引起的无菌性炎症归结为负面功能效应。绘制出生命信息安全控制功效图,并讨论了生命信息安全控制功效图的建立在理论方面的重要意义。

金鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定和药敏实验

从江西某地发病死亡金鱼体内分离到6株呈β-溶血的革兰氏阴性杆菌,对其进行鉴定、生化试验、动物试验,鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophi-la,Ah)。对该菌的致病性和敏感药物试验发现6株菌均具有较强的致病性,均能致死小鼠;该菌对氯霉素、链霉素、诺氟沙星等高度敏感,而对青霉素等药物不敏感。

猪病毒性腹泻的流行特点、疫苗及临床防控效果

1病毒性腹泻的病原学和流行病学1.1病原猪腹泻一直是困扰我国乃至全球养猪业的重要疾病。2010年底，大规模、严重猪腹泻在我国南方地区各养殖场暴发，此次大规模的猪腹泻主要表现为哺乳仔猪，特别是1周龄内仔猪的水样腹泻、呕吐、脱水等症状，发病率和死亡率可达80%~100%，后备母猪、经产母猪、公猪及育肥猪等主要表现为一过性水样腹泻。随后，该病迅速扩散至国内各养猪省份。

四种兽用抗生素的体外抑菌效果评价

本实验用试管药物稀释了四种兽用抗生素对猪常见病原菌和正常菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)。通过实验发现:各种菌对四种药物的敏感性存在很大的差异,大多数细菌对药物C和D较敏感而对药物A和B存在较严重的耐药。

一起由β溶血C群链球菌引起的母猪链球菌病的诊疗

南昌地区某养殖场发生以母猪排血尿为特征的一种疾病,经临诊诊断为链球菌病,病原分离及鉴定证实为属β溶血的C群链球菌。药敏试验结果表明复方新诺明、丁胺卡那霉素、强力霉素、氨苄青霉素和庆大霉素为高度敏感药物。

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对Gen Bank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳(N)蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒(PKoV)、猪星状病毒(PAstV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012—2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】1以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI Gen Bank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;2将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCo V序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;3本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;4所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×106拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×101拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×103拷贝/μL;5应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%(78/249),母猪粪便中PDCoV的检出率(27.78%)稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率(31.92%),最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012—2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。

以原核表达的猪δ冠状病毒N蛋白为包被抗原的间接ELISA方法的建立

为建立检测血清中猪δ冠状病毒(PDCoV)抗体的间接ELISA方法,本研究根据PDCoV的N基因序列设计特异性引物,扩增出N蛋白全基因序列,将其克隆至低温表达载体p Cold I中并转入BL21,诱导表达获得大小约为41 ku的可溶性目的蛋白;western blot试验表明所表达的蛋白具有反应活性。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立了PDCoV间接ELISA抗体检测方法。结果表明,本研究建立的ELISA方法阴阳性临界值为0.316,与猪流行性腹泻病毒等6种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性和稳定性均较好。应用建立的间接ELISA方法,对收集自江西各地区282份猪血清进行检测,阳性率为12.8%(36/282),表明PDCoV在我省猪群中普遍存在。本实验建立的PDCoV抗体捕获间接ELISA为临床上猪群PDCoV感染监测和流行病学调查提供了实验依据。

新现猪圆环病毒3型及圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的新现猪圆环病毒3型(PCV-3)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的OFR2基因设计了2对扩增PCV-3和PCV-2的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV-3和PCV-2的双重PCR方法。敏感性和特异性结果显示,该方法对PCV-3和PCV-2的最低核酸检测量均为1.0×103拷贝/μL,而对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)的扩增结果均为阴性。应用所建立的双重PCR检测了临床上256份样品,结果表明,PCV-3和PCV-2感染的阳性率分别为0.78%(2/256)和86.3%(221/256),仅有1份样品为PCV-3和PCV-2混合感染,混合感染阳性率为0.39%(2/256)。试验结果表明,本研究建立的PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中PCV-3和PCV-2的临床快速诊断和流行病学调查提供了一种工具。

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及药敏试验

2015年3月,江西省上饶市万年县某规模化养猪场部分肥猪出现体温升高、呼吸困难、咳嗽等症状,部分发病猪出现死亡,病死率为35%,疑似猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染。用TSA及鲜血培养基进行了胸膜肺炎放线杆菌的分离和纯化,经培养特性、染色镜检、生化试验及16SrDNA PCR鉴定等证明了分离菌为生物Ⅰ型胸膜肺炎放线杆菌。毒力基因检测表明该菌具有ApxⅣ毒力基因。药敏试验结果显示,分离菌对头孢哌酮、诺氟沙星高度敏感,对青霉素G耐药。

不同菌株配伍摇瓶发酵蛋白酶的初探

探索产蛋白酶不同芽孢杆菌产蛋白酶的协同作用以提高发酵产物的蛋白酶活性。采取酪素平板初筛的方法,从分离的芽孢杆菌中筛选出产蛋白酶活性较高的菌株,再通过菌株两两配伍发酵和三者配伍摇瓶发酵培养,采用Folin-酚法分别检测不同菌株配伍发酵产物的蛋白酶活性。酪素平板初筛结果表明,SH、TCP和B13株纳豆芽孢杆菌产蛋白酶活力高,SH和B1配伍发酵培养48 h后,酶活力比单菌株发酵分别提高了37.69%和59.23%。菌株之间的科学配伍在摇瓶发酵中能显著提高蛋白酶的活性。