Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体。采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达。经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体。获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础。

KLHL31促进C2C12细胞的肌原分化

人类KLHL31基因是本实验室已克隆的基因,其蛋白质含有保守的BTB和串连重复的Kelch结构域,已有报道表明其在人类成体骨骼肌和心肌组织中特异表达。RT-PCR分析表明在C2C12细胞肌原分化过程中过表达KLHL31能够提高肌原分化标志基因MyoD与Myogenin的转录水平;荧光报告系统分析发现过表达KLHL31能够增强肌原分化相关基因MCK启动子的活性,表明KLHL31能够促进C2C12细胞的肌原分化。

myh6蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中,myh6编码是一种促进心室心肌细胞扩张的转录因子。为了进一步研究myh6在心脏发育和心脏疾病发生中的功能,需要获得斑马鱼myh6蛋白并制备其抗体。从斑马鱼心脏组织中提收总RNA,通过反转录得到心脏组织特异表达基因的cDNA,PCR扩增得到myh6部分编码区序列,然后将其连接到pGEX-4T载体上获得原核表达。经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的特异性。结果显示,获得了myh6原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗myh6多克隆抗体,为myh6功能的进一步研究提供了有力的工具。

Nulp1基因抑制P19CL6细胞向心肌细胞分化

Nulp1基因是已克隆的一个新的bHLH转录因子亚家族成员。前期的研究表明:Nulp1蛋白作为一个转录抑制子对SRF信号途径有极强的抑制作用。为了进一步研究Nulp1基因在心肌分化中的作用,在能够高效分化为心肌细胞的P19CL6细胞系中过表达Nulp1基因,发现心肌分化标志基因的表达被抑制;用RNA干扰技术,使Nulp1基因在P19CL6细胞系中的内源表达降低,发现心肌分化标志基因的表达提高,说明Nulp1基因能够抑制P19CL6细胞系向心肌细胞的分化。