牛呼吸道合胞体病毒G蛋白特异性核酸适配体的筛选及初步应用

为筛选牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白特异性核酸适配体,本研究通过原核系统表达G蛋白,并利用软件设计引物,由公司合成初始寡核苷酸文库,并利用微孔板法,经过包被G蛋白、封闭后加入初始寡核苷酸文库、洗脱、酚抽取法提取、PCR扩增、胶回收以及反筛等操作经不同轮次筛选核酸适配体。在每轮筛选循环中,以回收产物为模板进行常规PCR扩增后再进行一轮非对称PCR扩增,获得目的条带大小为84 bp的单链核苷酸分子,用于下一轮筛选。共进行了11轮筛选,从第5轮开始反筛。将最后一轮筛选得到的对称PCR产物连接T载体后转化到DH5α感受态细胞中,经菌液PCR鉴定和测序后,利用间接酶联核酸适配体法(i-ELAA)选择测序结果出现频次较高的适配体,测定其与G蛋白的结合力,并利用软件预测其二级结构。结果显示,本实验表达了BRSV重组G蛋白,经微孔板法筛选出了98条适配体序列,其中G-6、G-13、G-39、G-55和G-72适配体出现频率最高;二级结构预测显示,5条核酸适配体均具有稳定的茎环状或发卡状结构,能与G蛋白特异、稳定的结合。本研究筛选出的5条核酸适配体为BRSV酶联核酸适配体法的建立奠定了基础。

碳量子点应用于鼠伤寒沙门菌检测的初步研究

旨在制备基于碳量子点(carbon quantum dots, CDs)的免疫荧光探针,初步建立鼠伤寒沙门菌的快速检测方法,以柠檬酸和尿素作为碳源,利用微波法对碳量子点制备的微波时间、透析袋规格等条件进行了优化,再使用化学偶联法将碳量子点与鼠伤寒沙门菌抗体结合制备免疫荧光探针C-IgG,使之借助抗原抗体特异性结合和荧光实现对鼠伤寒沙门菌的检测,最后通过荧光信号对探针的特异性及灵敏度进行检测。结果显示:微波时间为5 min,透析袋规格为MWCO=1 000时能获得粒径3~11 nm的理想碳量子点;该碳量子点激发波长为408 nm,紫外吸收峰位于337 nm,傅里叶变换红外光谱显示其含有羟基、羧基、氨基等常见官能团;制备的免疫荧光探针C-IgG能在短时间内特异性结合沙门菌并在荧光显微镜不同光束下呈多色荧光点,灵敏度为10;CFU/mL。结果表明:改变微波时间和透析袋规格可制备出粒径3~11 nm,表面多功能基团,用于鼠伤寒沙门菌检测的碳量子点,为进一步探索基于碳量子点的免疫荧光探针在鼠伤寒沙门菌检测中的应用提供了参考。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒噬菌体单链抗体库的构建和筛选

为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明:1)成功构建了库容量为4.3×10^(7)的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×10^(4);2)优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。