中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析

【目的】首次对中国来源于不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株(ZS1人株、PY猪株、GY猪株、ZC猪株、NT猪株、ZS人株、SH人株、CN猪株、QHO绵羊株)以及国际标准强毒RH株之间在529bp重复序列的变异进行研究,从而为进一步的分子诊断和分子遗传学研究以及弓形虫病的防制奠定基础。【方法】抽提基因组DNA后,用PCR方法对10个虫株的529bp重复序列进行扩增;扩增产物经纯化后克隆于pGEM-TEasy质粒载体,再经菌落PCR及酶切鉴定阳性克隆,然后对阳性克隆进行测序及序列分析。【结果】10个弓形虫虫株的529bp重复序列都不完全相同,它们之间的核苷酸序列变异范围为0.8%～2.9%。变异主要位于第32～55位碱基之间,这些碱基变异与虫株的宿主来源、地域来源及毒力之间没有相关性。【结论】529bp重复序列可作为遗传标记,用于弓形虫与其它寄生虫的种间鉴定,但不适合用于研究弓形虫的种内遗传变异。

片形吸虫线粒体nad1基因的序列分析及种系发育

为阐明来自中国、尼日尔、法国和美国的片形吸虫分离株在线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并以pnad1序列进行种系发育研究,利用PCR扩增了中国、尼日尔、法国和美国片形吸虫分离株的pnad1序列并与GenBankTM中片形吸虫相应序列进行了比较,进行了种系发育分析。结果显示,所有片形吸虫样品的pnad1序列长度均为446 bp,中国、尼日尔、法国和美国肝片吸虫分离株与GenBankTM公布的肝片吸虫相应序列的种内变异为0.2%～0.7%,0.2%～0.9%,0.9%～2.0%,0.2%～0.9%;中国及尼日尔大片吸虫分离株与已报道的大片吸虫相应序列的种内变异为1.8%～2.7%,1.8%～3.4%;中国中间型虫株与中国及尼日尔大片吸虫分离株以及网上报道的大片吸虫的序列差异为5.6%～6.3%,5.6%～7.8%,5.7%～8.1%。中间型片形吸虫在遗传学上介于大片吸虫与肝片吸虫之间,但与大片吸虫的遗传关系更近。表明,片形吸虫pnad1序列可作为种间鉴定及种内遗传变异研究的标记;在中国的确存在中间型片形吸虫。

我国犬钩虫ITS及5.8S rDNA的克隆与序列分析

以从我国广东湛江犬小肠中采集的2条犬钩虫作为研究对象,用保守引物NC5及NC2扩增犬钩虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR和酶切鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示,来自湛江的2条犬钩虫ITS及5.8S rDNA序列总长均为738 bp,其中ITS-1序列长为364 bp,5.8S序列长为153 bp,ITS-2序列长为221 bp;2个不同样品之间ITS序列存在多态性,ITS-1序列存在5个碱基的差异,ITS-2序列存在1个碱基的差异,5.8S rDNA序列无差异。研究结果为犬钩虫进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。

有齿食道口线虫ITS及5.8S DNA片段的PCR扩增、克隆及序列分析

运用 PCR 方法以保守引物 NC5 及 NC2 扩增了从广东阳江地区猪体分离的食道口线虫 rDNA 的内转录间隔区(ITS)及 5.8S 序列。将 PCR 扩增出的片段纯化后克隆至 pGEM-T Easy 载体,用 PCR 技术及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落质粒 DNA 进行测序。结果表明,扩增的片段大小为 828 bp,包含部分的 18S、28S 及全部的 ITS-1(362 bp)、5.8S(153 bp)及 ITS-2(217 bp)序列。序列比较表明,该食道口线虫为有齿食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪有齿食道口线虫的 ITS 及 5.8S 序列,为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因

为了筛选线虫的性别特异性基因,为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具,本研究选择猪蛔虫(Ascarissuum)为模型,分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后,采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库,并采用地高辛(DIG)标记的cDNA探针进行Southern杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明,雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析,发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs,5个新的ESTs;25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs,还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。

弓首蛔虫和狮弓蛔虫线粒体nad1基因部分序列多态性研究

【目的】对弓首属犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓属狮弓蛔虫线粒体DNA(mtDNA)中烟酰胺脱氢酶亚基I(nad1)基因部分序列(pnad1)进行比较研究,分析它们之间的序列差异和种群遗传关系。【方法】先用同位素(γ33P)标记上下游引物,通过PCR方法扩增出单个虫体线粒体pnad1片段,然后采用单链构象多态性(SSCP)分析技术对pnad1片段进行多态性研究,最后挑选出代表性样品进行测序,并利用基因分析软件DNAStar(版本5.01)对序列进行分析比较。【结果】犬弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为0.3%～1.9%,与猫弓首蛔虫、马来亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为11.0%～14.1%、10.7%～12.4%、12.6%～13.7%和17.5%～18.2%。猫弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为2.8%,与马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别是12.0%～13.0%、15.1%和18.6%～21.2%。马来西亚弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为0～0.3%,与牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别是12.4%～12.8%和18.6%～19.0%。【结论】犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和马来西亚弓首蛔虫不同地方虫株的pnad1序列都有一定差异(0～2.8%)。但种间pnad1的序列差异(10.7%～21.2%)明显高于种内的序列差异,说明nad1基因可以作为弓首蛔虫和狮弓蛔虫分子分类及种群遗传关系研究的遗传标记。

猪食道口线虫ITS-1和ITS-2rDNA的PCR-SSCP分析

以采自我国不同地区猪体的食道口线虫虫株为研究对象,PCR扩增出ITS-1和ITS-2序列片段,然后采用单链构象多态性(SSCP)方法分析PCR产物,对不同地区食道口线虫进行分子鉴定。所有样品经SSCP分析显示两种带型,第一种为有齿食道口线虫带型,另一种为未定种食道口线虫带型。代表性样品的测序结果表明,未定种食道口线虫带型的样品为四棘食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪四棘食道口线虫的ITS序列,并建立了区分有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的PCR-SSCP方法,从而为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

弓首蛔虫线粒体cox1基因的多态性研究

应用PCR SSCP技术和DNA 序列分析对犬弓首蛔虫(Toxocara canis)线粒体DNA(mtDNA)中的细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)进行了分析研究,并与弓首属的猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫及弓蛔属的狮弓蛔虫进行了种间比较。结果显示,犬弓首蛔虫种群内的pcox1 序列差异为2.72%,与马来西亚弓首蛔虫种群间的序列差异为11.38%,与猫弓首蛔虫种群间的序列差异为11. 20%,与牛弓首蛔虫种群间的序列差异为10.40%,与狮弓蛔虫种群间的序列差异为11.48%;马来西亚弓首蛔虫种群内的pcox1 序列差异为0.57%,与猫弓首蛔虫的序列差异为8.23%,与牛弓首蛔虫的序列差异为8.70%,与狮弓蛔虫的序列差异为10.60%。研究证实,犬弓首蛔虫不同地方虫株的pcox1 有一定差异,与同属其他种类及狮弓蛔虫的差异较大;马来西亚弓首蛔虫确为一独立种。

我国片形吸虫(Fasciola)线粒体细胞色素c氧化酶亚基基因(cox1)部分序列的多态性

用33P对引物进行标记,对来自国内不同地区不同宿主的片形吸虫(Fasciola)的线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基基因(pcox1)部分序列进行PCR扩增及DNA单链构象多态性(SSCP)分析,结果76个虫体均成功地扩增出约450bp的基因片段;SSCP分析显示,不同地区或同一地区的不同样品在pcox1的SSCP带型上存在多态性;代表性样品的测序结果表明,其碱基序列存在差异。试验结果显示,我国片形吸虫pcox1序列种内变异不明显,种间变异显著,表明cox1序列可以作为片形吸虫分类鉴定中一个可靠的遗传标记。

片形吸虫第一内转录间隔区DNA多态性的研究

以不同地区的片形吸虫虫株为研究对象 ,经PCR扩增出了ITS 1部分基因片段 ,采用单链构象多态性 (SSCP)方法 ,并结合序列分析研究了不同地区片形吸虫ITS 1DNA的多态性。不同地区的样品经SSCP分析 ,显示 3种带型 ,第 1种为大片形吸虫的带型 ,第 2种为肝片形吸虫的带型 ,第 3种为 2种带形的混合带型。广西区样品和大部分贵州省样品属于大片形吸虫带型 ;四川省、黑龙江省和部分贵州省样品为混合带型 ;南京市和甘肃省样品为肝片形吸虫带型或混合带型。测序结果表明 ,根据ITS 1基因的序列变异位点可区分 2种片形吸虫 ;表现为混合带型的样品在变异位点具有多态性。本研究结果显示 ,ITS 1片段可作为遗传标记用以区分大片形吸虫和肝片形吸虫 ,同时也证实 ,在我国除了这 2种片形吸虫外 ,还可能存在着“中间型”

用PCR-RFLP技术鉴别鲁道夫对盲囊线虫姊妹种的研究

用保守引物扩增鲁道夫对盲囊线虫Contracaecumrudolphii姊妹种和C .septentrionalerDNA第一内转录间隔区(ITS 1)片段并纯化,根据鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B和C .septentrionalerDNAITS 1序列,选用限制性内切酶MspΙ和NsiI酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析.结果经MspΙ酶切后,鲁道夫对盲囊线虫姊妹种与C .septentrionale表现出不同的条带;经NsiΙ酶切后,鲁道夫对盲囊线虫B和C .septentrionale结果一致,与鲁道夫对盲囊线虫A不同.用MspΙ可以鉴定出C .septentrionale ,用NsiΙ可以鉴定出鲁道夫对盲囊线虫A ,2个限制性内切酶合用可以将鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B以及C .septentrionale分别鉴定出来.根据鲁道夫对盲囊线虫A、鲁道夫对盲囊线虫B以及C .septentrionalerDNAITS 1基因序列建立的鲁道夫对盲囊线虫姊妹种PCR RFLP鉴别技术能够对鲁道夫对盲囊线虫姊妹种进行准确。

弓首蛔虫及狮弓蛔虫线粒体基因组nad4基因多态性研究

目的比较犬、猫常见蛔虫的线粒体DNA(mtDNA)中烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ基因(nad4)部分序列(pnad4),以期找出它们之间的序列差异和种群遗传关系。方法抽提61个弓首属蛔虫(包括犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫和犊弓首蛔虫)和狮弓蛔虫虫体的总DNA,用PCR方法扩增mtDNApnad4,然后用SSCP技术和DNA测序对序列进行分析研究。结果犬弓首蛔虫种群内pnad4的序列差异为1.17%,与猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫种间的平均序列差异分别为13.92%、16.48%、15.12%和20.32%。猫弓首蛔虫种群内pnad4的序列差异为1.00%,与马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫、狮弓蛔虫平均序列差异分别是17.90%、13.55%和18.50%。马来西亚弓首蛔虫种群内pnad4序列差异为0.13%,与牛弓首蛔虫、狮弓蛔虫序列差异分别为13.50%和20.60%。结论犬弓首蛔虫不同地方虫株的pnad4有一定差异,猫弓首蛔虫种群内差异较小,马来西亚弓首蛔虫种群内差异很小。弓首属各虫种之间的差异以及与狮弓蛔虫的差异都较大。马来西亚弓首蛔虫pnad4序列与其它虫种差异都较大,证明它确为一独立种。pnad4序列是弓首蛔虫和狮弓蛔虫理想的种特异的遗传标记。

鸡异刺线虫ITS rDNA的PCR扩增、克隆及序列分析

应用PCR方法用保守引物NC5及NC2,扩增了从广州地区鸡体分离的鸡异刺线虫rDNA的第一、第二内转录间隔区(ITS-1,ITS-2)及5.8S基因。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEasy载体,用菌落PCR及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落进行测序。试验结果表明,ITS-1长为428bp,ITS-2长为386bp。通过与网上发表的来自澳大利亚的鸡异刺线虫基因序列比较结果表明,广州鸡体内的异刺线虫和澳大利亚鸡异刺线虫的ITS-2序列是完全一样的,ITS-1序列有微小差异,广州鸡的2个不同虫体样本的ITS序列完全一致。本项研究结果为鸡异刺线虫的进一步分子生物学研究奠定了基础,并为寄生虫分子系统学研究提供了资料。

广州口岸进口海鱼的异尖线虫幼虫感染情况调查

异尖线虫病是由食人异尖线虫科某些属的活的第三期幼虫感染而引起的．最早由荷兰的VanThiel报道．随后大量病例在日本、韩国和法国等国家出现．该病属于海洋自然疫源性疾病．大量存在于海洋动物中。到目前为止根据报道可以感染人的异尖线虫主要有六种，即典型异尖线虫（A．typica）、简单异尖线虫（Anisakis simplex）、对盲囊线虫（Contracaccum spp．）、宫脂线虫（Hysterothylacium spp．1、抹香鲸异尖线虫（A．physeteris）和拟地新线虫（Pseudoterranova decipiens）。

用SMART技术构建猪蛔虫雌虫cDNA文库

为克隆出与猪蛔虫产卵或发育相关基因的全长序列,本研究根据SMART(Switching mechanism at5'end of RNA transcript)技术,采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了猪蛔虫雌虫的全长cDNA文库。用TriPure Isolation Reagent和Poly(A)PuristTM试剂盒提取mRNA后,以逆转录酶PowerScriptTM反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA。扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400TM柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB(带有SfiⅠA和B两个位点)质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH5α内得到原始文库,扩增后的文库保存在96孔细胞培养板中。经测定,构建的cDNA文库约含有1.6×106个重组子,重组效率达100%,插入片段多在0.4kb～2kb之间,平均插入片段长度约1.2kb,扩增后文库滴度为3×109CFU/mL。结果表明猪蛔虫雌虫的全长cDNA文库已构建成功,从而为筛选猪蛔虫雌虫的功能基因全长序列奠定了基础。

应用cDNA微阵列芯片技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因的研究

采用cDNA微阵列芯片技术,从所构建的猪蛔虫雌、雄成虫cDNA消减文库分别挑取1 044和1 119个克隆,PCR扩增其插入片段,经纯化后点样于预先处理好的基片上(双点杂交),制备成cDNA微阵列芯片。将分别标记荧光素Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的雌虫和雄虫cDNA探针,与制备好的cDNA芯片杂交(平行进行反标杂交试验)。根据每个点杂交后的Ratio值,筛选出双点杂交和正反标中都同时具有表达差异的基因克隆共1 559个。将表达差异最明显的前831个克隆进行测序,获得720个有效序列,经生物信息学分析发现,雄虫特异表达的主要精子蛋白和雌虫特异表达的卵巢信息蛋白的基因序列多数与新杆属线虫存在同源性,有31个可能是新的ESTs。性别差异表达基因及其相关生物信息的获得为下一步研究基因功能奠定了基础。

2例猪弓形虫病的特异PCR诊断与虫株分离

目的应用特异PCR方法诊断猪弓形虫病并通过动物接种的方法分离弓形虫虫株。方法用涂片镜检、特异PCR方法检测病料,用经PCR方法检测为阳性的病料接种小白鼠,经连续传代分离弓形虫虫株。结果病例1的肺及肺门淋巴结涂片镜检见有少量的弓形虫滋养体,但病例2的颌下淋巴结及肺门淋巴结涂片镜检未见有弓形虫滋养体。用特异PCR方法检测两个病例的上述病料,均得到弓形虫的特异条带。小白鼠接种试验从每个病例均分离出一个弓形虫虫株。结论特异PCR诊断方法能较快速、准确地检测猪弓形虫病,小白鼠接种试验是一种较好的弓形虫虫株分离方法。