钙敏感受体参与高糖诱导的内皮细胞内质网应激的作用研究

目的研究敏感受体(CaSR)在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的表达及其与内质网应激的关系。方法将HUVEC细胞分为正常糖对照组(NG组)、高糖组(HG组)、正常糖+CaSR激动剂组(NG+GdCl3组)、高糖+CaSR拮抗剂组(HG+NPS-2390组),以不同条件孵育72 h。用CCK-8法检测细胞存活率,用试剂盒检测乳酸脱氢酶、一氧化氮、脂质过氧化物、活性氧和细胞内钙离子的水平。用Western blot法检测CaSR和细胞内质网应激标志性蛋白的表达水平。结果HG组和NG+GdCl3组的细胞存活率下降,LDH漏出增多,细胞内钙离子浓度升高,CaSR蛋白表达增多,氧化应激反应增强,内质网应激标志蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1α蛋白表达水平增高,说明高糖和CaSR激活会导致HUVEC细胞损伤,发生内质网应激。HG+NPS-2390组细胞损伤、氧化应激和内质网应激明显减轻。结论CaSR参与了高糖导致的HUVEC细胞损伤和内质网应激,抑制CaSR,可减轻高糖导致的内皮细胞损伤。

白杨素减轻人脐静脉内皮细胞的氧化应激损伤

目的:观察白杨素对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)氧化应激损伤的保护作用。方法:常规培养HUVEC细胞,分为5组:对照组,不加任何干预;H2O2组,用400μmol/L过氧化氢处理2 h;白杨素高、中、低剂量组,提前用100、50、25μmol/L的白杨素孵育12 h,然后用400μmol/L过氧化氢处理2 h。处理结束后,用MTT法检测活细胞数目,并检测乳酸脱氢酶(LDH)的漏出。收集细胞上清液及细胞裂解液,检测NO、丙二醛(MDA)产量及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。用荧光染料DCEF-DA染色后,酶标仪检测活性氧(ROS)的产量。用荧光定量RTPCR的方法检测黏附分子的表达。结果:过氧化氢导致内皮细胞活细胞数目减少,LDH漏出增多,MDA、ROS产生增多,SOD活性下降,黏附分子表达增多,内皮细胞NO产生减少,eNOS活性下降。提前用白杨素预孵,可以增加细胞存活率,减轻氧化应激损伤,减少黏附分子的表达,eNOS蛋白活性增加,细胞NO的产量增加。结论:白杨素可以减轻HUVEC的氧化应激损伤,减少黏附分子的表达,增加细胞NO的合成能力。

熊果酸减轻高糖高脂诱导的人主动脉内皮细胞损伤

目的:探讨熊果酸(ursolic acid,UA)对人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAEC)高糖高脂损伤的影响及机制。方法:MTT法选取合适的高糖和棕榈酸钠(sodium palmitate,SPA)损伤浓度以及UA预孵浓度。采用试剂盒检测NO、ROS的含量,乳酸脱氢酶(LDH)的释放率以及抗氧化酶包括总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。Western blot法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、细胞间黏附分子(ICAM-1)、血管细胞黏附分子(VCAM-1)、半胱天冬酶-1(caspase-1)以及GSDMD的蛋白表达情况。Hoechst33342联合PI荧光染色检测细胞膜的完整状态以探讨焦亡发生情况。观察UA对HAEC的保护作用。结果:预孵UA(1μmol/L和5μmol/L)可以减轻高糖高脂(30 mmol/L GLU+0.1 mmol/L SPA)造成的HAEC损伤,提升HAEC活力,减轻氧化应激损伤,增加NO的释放和eNOS的蛋白表达,减少黏附分子的蛋白表达,减少细胞焦亡。结论:UA可能通过减轻高糖高脂诱导的HAEC氧化应激反应,抑制细胞焦亡的发生,减轻内皮细胞损伤。

Nox1/4抑制剂减轻脂多糖致人脐静脉融合细胞的损伤

目的研究Nox1/4抑制剂对脂多糖致人脐静脉融合细胞EA.hy926损伤的保护作用及相关机制。方法将EA.hy926细胞分为对照组、LPS(脂多糖)组、Nox1/4抑制剂(GKT137831)+LPS组。CCK8法检测细胞活力;试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)与一氧化氮(NO)的含量;免疫荧光法检测细胞内活性氧(ROS)的水平;ELISA检测细胞IL-1β、IL-6的分泌情况;Western blot检测细胞内内质网应激标志性蛋白表达水平。结果 LPS组较对照组比较,NO的释放量、ROS生成量以及炎性因子IL-1β和IL-6释放量明显增加(P<0.05);使用Nox1/4抑制剂干预后,ROS产生以及NO、IL-1β和IL-6的释放量明显降低(P<0.05)。与对照组相比,LPS组细胞内GRP78、p-PERK、ATF6和IREα蛋白表达上调,提示内质网应激被激活;Nox1/4抑制剂干预后,内质网应激标志性蛋白表达下降。结论 Nox1/4抑制剂减轻了LPS诱导的EA.hy926细胞内质网应激损伤。其作用机制可能是通过减少细胞内Nox1/4来源的ROS的生成,抑制内质网应激,进而减轻炎性反应,改善内皮功能。