miRNA-7靶向SP1的3′UTR双荧光素酶报告基因载体构建及评价

目的:构建胃癌细胞核转录因子SP1的3′非翻译区(3′UTR)双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-7(miR-7)调控SP1的分子机制。方法:应用相关生物信息学软件预测miR-7靶向作用于SP1基因的3′UTR区;PCR扩增人胃黏膜上皮细胞SP1的3′UTR,插入至psiCHECK2载体双荧光素酶基因下游,构建野生型(w-3′UTR)和突变型重组表达载体(m-3′UTR),鉴定正确后,分别与miR-7模拟物(mimics)/抑制物(inhibitor)/阴性对照物(NC)共转染胃癌细胞MKN45,检测荧光素酶活性及SP1表达情况。结果:成功构建SP1的3′UTR野生型(psiCHECK2-SP1-w-3′UTR)和突变型(psiCHECK2-SP1-m-3′UTR)表达载体,双荧光素酶报告基因检测显示w-3′UTR/miR-7-mimics组的相对荧光素酶活性表达受抑制,与miR-7 NC组比较降低75%,差异具有统计学意义(P<0.001),而m-3′UTR/miR-7-mimics组的活性表达没有受到影响(P>0.05)。RT-PCR和Western blot检测结果显示miR-7-mimics组SP1表达水平低于miR-7 NC组(P<0.001),而miR-7-inhibitor组SP1表达水平高于miR-7 NC组(P<0.001)。结论:成功构建SP1的3′UTR野生型双荧光素酶报告基因表达载体,miR-7能够显著降低其荧光素酶活性,提示miR-7能靶向负调控SP1的表达。