产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化

从大连海域的海参肠道中筛选得到一株产碱性蛋白酶较高的海洋细菌HS-A156，经形态学和16SrDNA序列分析初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）（GenBank检索号KCl66863）。对菌株HS-A156的酶学性质进行初步研究，结果表明该菌株所产蛋白酶最适作用pH为9．0，在pH8．O～11．0性能稳定；最适作用温度为40℃，在25～45℃具有良好的热稳定性。同时对该菌株产酶发酵培养基和发酵条件进行优化，确定了最适产酶培养基组成为葡萄糖1．5％、牛肉膏1．0％、酵母粉2．0％、CaCl20．05％；最佳发酵条件培养基初始pH8．0、发酵温度30℃、接种量3％。经过优化后菌株HS-A156产碱性蛋白酶的酶活力达到538U／mL，比优化前的产酶量提高了3．7倍。

海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母中的重组表达

为构建并筛选具有抑菌活性的重组海参溶菌酶C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌,根据已构建的pMD18-T-SjLys-C质粒为模板,设计特异性引物,扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。该重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度抗生素G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,再经1%甲醇诱导表达,共筛选出4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,该酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,其目的蛋白表达量最高,并对革兰阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。