梅毒螺旋体TpN15-47融合基因原核表达系统的构建

目的构建梅毒螺旋体TpN15-47融合基因及其原核表达系统。方法分别克隆TpN15和TpN47基因,利用T4连接酶构建TpN15-47融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白TpN15-47表达情况。结果连接的TpN15-47基因测序分析表明,插入的基因片段为TpN15-47融合基因,与GenBank报道相同。目的重组蛋白TpN15-47表达产量约为细菌总蛋白85.79%,主要以包涵体形式存在。结论所构建的原核表达系统能高效地表达TpN15-47融合蛋白,为后期梅毒螺旋体基因疫苗和临床检测试剂盒的研制奠定了基础。

TpN17重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的初步应用

目的用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN17重组抗原,并建立操作简便、特异性好、敏感性高的梅毒血清抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。方法采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN17基因,再进行T-A克隆及测序,然后亚克隆到原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白包被于反应板,建立检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法,利用该法与梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)同时检测血清样品,对其结果进行比较研究。结果TpN17重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达,并成功建立了检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法及试剂。对135例梅毒可疑患者血清进行检测,ELISA、TPHA和TRUST的检出阳性率分别为82.96%、98.52%和71.11%,而TRUST测出的8例可疑样品及31例阴性样品中,TPHA结果全部阳性、而ELISA只有2例阴性。结论TpN17重组抗原ELISA试剂在特异性和敏感性上明显优于TRUST法。

TpN47重组抗原的表达及其产物反应原性的初步鉴定

目的探讨梅毒螺旋体外膜蛋白(TpN47)重组抗原及其临床意义。方法采用PCR技术扩增TpN47重组抗原,再进行T-A克隆及测序,然后亚克隆至原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白作为抗原制备酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒,对正常人血清200份、类风湿性关节炎(RA)阳性血清55份、系统性红斑狼疮(SLE)阳性血清34份及梅毒可疑患者阳性血清135份进行检测,其结果与梅毒血凝试验(TPHA)、梅毒甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)的检测结果进行比较。结果成功地构建了pET32-TpN47重组表达载体,重组的TpN47蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。对梅毒可疑阳性血清采用ELISA、TPHA、TRUST检出阳性率分别为81.48%、98.52%、71.11%;TRUST测出的8份可疑阳性样品及31份阴性样品TPHA检测结果均为阳性,而ELISA检测结果阳性19份。ELISA检测阳性率与TRUST和TPHA比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论TpN47重组抗原具有较好的免疫反应活性,ELISA试剂特异性、敏感性次于TPHA,但明显高于TRUST。

宫颈癌组织中HPV16 URR基因多态性分析

目的 分析宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型（HPV16）上游调控区（URR）基因多态性.方法 收集宫颈癌组织标本25例,提取DNA作为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增URR目的 片段,扩增产物直接或构建克隆重组质粒后测序,以GenBank Blast软件分析序列.结果 宫颈癌组织标本中,HPV16检出率为72%（18/25）;检出10种HPV16 URR核苷酸突变模式,同源性在98.67%～99.69%之间;检出3个URR序列中的热突变位点,分别为G7520A（100.00%）、G7192T（100.00%）和T7713G（33.33%）.结论 宫颈癌组织中HPV16 URR存在多种基因突变类型和模式,可能与病毒致癌潜能及宫颈癌的发生相关.

梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达

目的：用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原，为进一步研制梅毒螺旋体疫苗和ELISA诊断试剂盒奠定基础。方法：采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因，进行T-A克隆及测序，然后亚克隆到原核表达载体中，以亲和层析法纯化重组蛋白。结果：成功地构建了pET32-TpN15重组表达载体，TpN15重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。结论：梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为临床检测梅毒感染的新方法和梅毒螺旋体疫苗的研制奠定了基础。

ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白(rltB-TpN47)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。

淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因序列分析及原核表达系统的构建

目的:分析本地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因核苷酸及氨基酸序列,构建PIA基因的原核表达系统。方法:采用高保真PCR扩增9株淋病奈瑟菌全长PIA基因序列,T-A克隆测序后与GenBank公布的序列进行同源性比较。构建PIA原核表达系统。采用不同浓度IPTG诱导重组目的蛋白rPIA表达,10%SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rPIA表达情况。采用Ni-NTA亲和层析法提纯rPIA,SDS-PAGE检测提纯效果。结果:与报道的PIA基因序列(GenBankNo:L19962)比较,9株淋病奈瑟菌核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.6%-100%和99.1%-100%,均属于IA6血清型。rPIA表达量可占细菌总蛋白量的50.1%,提纯后仅显示单一的目的蛋白条带。结论:IA6为本地区淋病奈瑟菌优势血清型,该基因序列相当保守。所构建的PIA基因原核表达系统能高效表达rPIA,为今后研制淋病奈瑟菌血清学检测试剂盒及疫苗研制奠定了基础。

血液学检验实践技能在临床应用的调查分析

通过对二级、三级医院检验科开展化验项目的调查分析,发现《血液学检验》教材中有关骨髓细胞形态学知识和技能在临床实际工作中广泛应用,而溶血性疾病和血栓与止血功能障碍性疾病的有关检验开展项目较少,同时一些新的技术如流式细胞术、骨髓活检等临床逐渐开展。因此,在教学内容和课时安排上,应及时改进和调整,加强临床应用技能的训练,以适应医学检验技术的发展。

基于问题导向的弹性制早期临床实践平台构建与实践——以医学检验技术专业为例

建立校内服务平台和兼职导师制临床跟岗实践平台,开展弹性制早期临床实践。该实践活动既不影响正常教学,又能弥补校内实训在"生物安全教育、实验室信息化管理、实验室质量控制、检测仪器使用与维护、检验报告综合分析、形态学辨认"六个方面不足,增加了"全真体验";使课内训练的各种单项技能得到综合性地运用,培养了临床思维,提高综合分析能力,强化了服务意识、责任意识和质量意识,有力地促进了职业素养的养成。开展弹性制早期临床实践是提高职业能力和职业素养的有效途径。

脐带间充质干细胞对高氧致新生大鼠肺损伤的保护作用

目的探讨脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对高氧致新生大鼠肺损伤的保护作用及其分子机制。方法将出生24 h内的96只新生Sprague-Dawley大鼠随机分为空气对照组、UC-MSCs对照组、支气管肺炎发育不良(BPD)模型组、UC-MSCs治疗组,每组24只。比较各组大鼠体重、支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白、总细胞计数、中性粒细胞计数及外周血白细胞介素(IL)-1β、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)指标水平变化,并对各组肺组织原纤维蛋白-1(FBN1)、FBN2、Fibulin mRNA表达水平进行比较。结果UC-MSCs治疗组大鼠第14、21天体重与BPD模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。BPD模型组、UC-MSCs治疗组大鼠BALF中总蛋白、总细胞计数及中性粒细胞计数水平分别与空气对照组、UC-MSCs对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。UC-MSCs治疗组大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞计数及总蛋白水平均明显低于BPD模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。UC-MSCs治疗组大鼠肺泡平均截距低于BPD模型组,而辐射状肺泡计数高于BPD模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。UC-MSCs治疗组大鼠外周血IL-1β、IL-8、TNF-α、MDA水平及SOD、MPO活性与BPD模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。UC-MSCs治疗组大鼠肺组织中FBN1、FBN2、Fibulin mRNA表达水平较BPD模型组明显下调,且与其他各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论UC-MSCs可通过抑制高氧暴露所致机体氧化应激反应和肺部炎症因子释放,以及阻断肺组织弹性蛋白平衡絮乱,从而减轻新生大鼠高氧肺损伤。

孟鲁司特对哮喘大鼠骨髓CD_(34)^+细胞IL-4 mRNA和IL-4蛋白表达的影响

目的:研究IL-4mRNA和IL-4蛋白在哮喘大鼠CD34+细胞中的转录表达及孟鲁司特(montelukast,MK)对其表达的影响。方法:将SD大鼠随机分为3组:哮喘组、MK组和正常对照组。用卵白蛋白制备大鼠哮喘模型。应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定血浆中IL-4和γ-干扰素(IFN-γ)浓度;用MiniMACS磁珠分选系统分离骨髓CD34+细胞;采用SYBR GREEN I荧光实时定量PCR法测定CD34+细胞中IL-4 mRNA的相对表达量。采用免疫组化技术测定CD34+细胞中IL-4蛋白的表达量。结果:哮喘组骨髓CD34+细胞中IL-4mRNA和IL-4蛋白的表达量高于其它各组(P<0.01);哮喘组除了IFN-γ水平低外,IL-4浓度和嗜酸性粒细胞(Eos)绝对值都是三组中最高的(P<0.01);除哮喘组外,其余组的各项指标相近(P>0.05)。IL-4 mRNA表达量与IL-4浓度、Eos绝对值呈正相关(P<0.01),与IFN-γ浓度呈负相关(P<0.01)。结论:哮喘大鼠骨髓CD34+细胞中IL-4mRNA的表达增强;孟鲁司特可以下调IL-4mRNA的表达,可能成为其抑制哮喘气道炎症形成的重要机制之一。

乙型肝炎病毒DNA阳性患者血清中前S_1蛋白的检测及其临床意义

乙型肝炎病毒的外层衣壳上存在主要蛋白、中分子蛋白和大分子蛋白.这3种蛋白含有表面抗原(HBsAg)、前S1蛋白和前S2蛋白.中分子蛋白的N末端加上128个氨基酸序列构成大分子蛋白,这128个氨基酸序列就是前S1蛋白的所在部位.前S1蛋白的21-47肽段是HBV感染肝细胞的结合位点,与HBV侵入肝细胞有关.本文通过对212例乙肝患者血标本进行前S1蛋白、乙肝三系及HBV-DNA的联合检测,对它们作相关分析,并探讨乙型肝炎病毒(HBV)DNA阳性患者血清中前S1蛋白的检测意义.

临床检验基础实践技能在临床应用的调查分析

对二级医院、三级医院检验科开展的化验项目进行调查，发现《临床检验基础》教材中一些实践技能项目已被逐渐淘汰或被其他方法替代，而一些原来不够重视的新项目已局部或广泛开展，尤其是检验仪器的使用越来越普遍，因此。应及时调整教学内容和课时，以适应医学检验技术的发展。

翠云草黄酮类化合物对哮喘大鼠模型中卵清蛋白诱导的气道炎症的改善作用

翠云草黄酮类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒等多种功效,其在治疗肺部疾病方面具有较高的应用价值。为考察翠云草黄酮类化合物对哮喘大鼠模型中卵清蛋白诱导的气道炎症的改善作用及机制,本研究建立了卵清蛋白诱导的哮喘大鼠模型,然后按照100 mg/kg的剂量对大鼠灌胃翠云草黄酮类化合物溶液,共灌胃1周。苏木精和伊红(HE)染色显示翠云草黄酮类化合物有效降低了大鼠肺组织中炎症细胞浸润程度(p<0.05),翠云草黄酮类化合物可降低大鼠血清IFN-γ、TNF-α和IL-6水平,并提高IL-4、IL-10和IL-13水平(p<0.05)。此外,翠云草黄酮类化合物显著抑制大鼠血清中总IgE和卵清蛋白特异性IgE水平(p<0.05)。免疫染色显示,翠云草黄酮类化合物显著抑制大鼠肺组织的Eotaxin阳性表达(p<0.05)。RT-PCR和Western blotting结果显示,翠云草黄酮类化合物可以显著增加哮喘大鼠肺组织中T2R10的表达,并降低IP3R1、Orai1、NFATc1和c-Myc的表达。本研究表明翠云草黄酮类化合物可有效减弱哮喘大鼠模型的肺组织病变程度,抑制炎症介质和炎症趋化因子的表达。其对哮喘的治疗作用与调节调节T2R10信号通路有关。