GPC3-WNT-JNK通路介导脂多糖诱导肺局部细胞炎症

目的:探讨GPC3在脂多糖(LPS)诱导的气道上皮细胞局部炎症微环境中的重要作用,并以GPC3-WNT通路介导的调控机制为核心进一步研究LPS诱导的肺局部炎症分子机制。方法:LPS经气道滴入小鼠后模拟肺损伤模型,检测肺泡灌洗液及肺组织中GPC3表达情况以及其表达位置。培养人肺16HBE细胞,LPS刺激16HBE细胞建立急性炎症细胞,予以RT-PCR检测其细胞中GPC3、TNF-α和TGF-β的mRNA表达情况,予以WesternBlot检测GPC3、TGF-β和TNF-α蛋白表达情况。加入外源性GPC3刺激16HBE细胞,建立GPC3高表达细胞模型,检测炎症因子TNF-α和TGF-β mRNA的表达情况。不同浓度GPC3-WNT通路抑制剂处理细胞,观察上述指标变化。结果:LPS诱导ALI小鼠模型显示GPC3表达水平显著提高。此外,LPS在体外也产生了GPC3表达升高的现象。同时,外源性GPC3蛋白刺激支气管上皮细胞产生多种炎症因子,可能提示GPC3具有促炎作用。此外,GPC3诱导支气管上皮细胞系炎性细胞因子的产生被WNT-JNK通路的抑制剂阻断,提示ALI/ARDS过程中GPC3参与肺局部的潜在信号通路。结论:LPS刺激支气管上皮细胞的过程中存在一条线性信号通路即GPC3-WNT-JNK。这一发现可能为ALI/ARDS的治疗和生物标志物的开发提供一个新的分子靶点和分子机制。

CCN1基因肺特异性条件敲除小鼠模型的构建和鉴定

目的:构建Cre重组酶系统调控的肺特异性的富半胱氨酸血管生成诱导因子61(CYR61,又称CCN1)基因条件敲除小鼠,为肺组织内CCN1在炎症中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法:将引进的CCN1^(flox/flox)转基因小鼠和肺上皮细胞特异性表达Cre重组酶工具鼠分别进行繁殖和鉴定,然后将2种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Cre^(+/-)CCN1^(flox/flox)的小鼠为本研究所构建的肺上皮细胞特异性CCN1基因条件敲除小鼠。结果:Cre^(+/-)CCN1^(flox/flox)的小鼠被成功繁殖并鉴定。使用他莫昔芬腹腔注射处理Cre^(+/-)CCN1^(flox/flox)实验组及Cre^(-/-)CCN1^(flox/flox)对照组,分别使用RT-PCR、免疫荧光、免疫组织化学、Western blot检测肺组织中CCN1的mRNA和蛋白表达,与对照组比可见实验组肺组织中CCN1的mRNA和蛋白表达均明显下降。结论:本研究基于Cre-Lox P技术成功构建了肺上皮细胞特异性CCN1基因条件敲除小鼠,并能稳定传代,可为进一步研究CCN1在肺组织内炎症中调控作用和机制奠定了动物模型的基础。

CCN1在脂多糖诱导急性肺损伤中的表达调控和在炎症反应中的作用

目的:体内观察富半胱氨酸蛋白61(CYR61/CCN1)在正常肺组织中的表达定位和在脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤中的表达变化,体外研究LPS调控CCN1表达的分子机制和CCN1在LPS诱导炎症介质表达中的作用。方法:分别通过免疫组化(IHC)染色及免疫荧光法观察CCN1在小鼠肺组织和气道上皮细胞16HBE中的表达定位;气道滴注LPS建立小鼠急性肺损伤模型,IHC观察CCN1在肺组织中的表达变化;体外研究中,分别予气道上皮16HBE细胞以ERK1/2、JNK、P38和PI3K信号通路特异性抑制剂预处理2 h后加入LPS刺激,通过RT-qPCR和Western blot检测CCN1的mRNA和蛋白表达变化;分别通过CCN1-siRNA和重组CCN1蛋白刺激16HBE细胞,qPCR检测炎症介质白细胞介素6(IL-6)、IL-8、转化生长因子β(TGF-β)和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA水平。结果:CCN1在正常肺组织中以气道上皮表达为主,在LPS诱导的急性肺损伤小鼠气道上皮细胞中CCN1表达升高;LPS可刺激16HBE细胞中CCN1的表达水平升高,其中ERK1/2、JNK、P38和PI3K信号通路特异性抑制剂可以不同程度逆转LPS诱导的CCN1表达升高。重组CCN1蛋白可以诱导16HBE细胞中IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA合成,干扰CCN1可以部分逆转LPS刺激后IL-6、IL-8、TGF-β和VEGF的mRNA合成。结论:气道上皮来源的CCN1在急性肺损伤中表达升高,其表达调控涉及ERK1/2、JNK、P38和PI3K信号通路;CCN1在介导LPS诱导的炎症介质表达过程中发挥了重要作用。本研究为未来急性肺损伤诊治的潜在靶点提供了一定的理论基础。

基质蛋白CCN1与肺部疾病的研究进展

富半胱氨酸蛋白61（cysteine-richangiogenicinducer61，Cyr61/CCN1）是即刻早期基因（earlygrowthresponsegene,Egr)编码的富含半胱氨酸的分泌型基质蛋白，属于CCN家族成员之一。CCN家族包括CCN1、结缔组织生长因子、肾母细胞瘤过度表达基因、Wnt诱导分泌蛋白(Wnt-inducedsecretedprotein,WISP)-1、WISP-2和WISP-36个成员。其中CCN1广泛表达于肺脏不同类型细胞和胞外基质，参与细胞生长、分化、凋亡、黏附和迁移等多种生理功能的调控［1］。Pais等［2］利用转录组分析C57BL/6J鼠和胰岛素样生长因子1(insulinlikegrowthfactor1,IGF1)基因敲除鼠,发现CCN1基因与肺发育成熟中的气道膈改造和远端上皮成熟相关，是IGF1/IGF1R轴在参与胚胎肺成熟发育中的调控基因。在正常生理情况下，CCN1参与肺泡的成熟和胞外基质的生成；在不同肺部疾病中，肺脏不同类型细胞CCN1发生异常表达和差异调控。本文检索了近年来基质蛋白CCN1与肺部疾病中的肺损伤、慢性阻塞性肺病（chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)和肺癌相关性的文献报道，就CCN1在不同肺部疾病中的研究进展作一综述，以期望为肺部疾病的预防治疗寻找潜在的分子标记物和治疗靶点。

TGF-β1调控肺泡上皮细胞PI3K亚基构成变化的研究

目的探讨肺泡上皮细胞(AECs)中PI3K亚基的表达情况和TGF-β1是否可以调控PI3K亚基的构成变化。方法采用实时定量PCR法检测AECs中PI3K亚基mRNA的表达情况,予5ng/ml TGF-β1刺激A549细胞0、3、6、12、24和48h不同时间点,实时定量PCR法检测PI3K亚基mRNA的表达变化,Western blot法检测PIK3CD蛋白表达水平。结果 AECs中Ⅰ型PI3K催化亚基以表达PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD为主,Ⅰ型PI3K调节亚基以表达PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3为主,Ⅱ型PI3K亚基和Ⅲ型PI3K亚基以表达PIK3R4、PIK3C3、PIK3C2A和PIK3C2B为主。TGF-β1刺激可以调控Ⅰ型PI3K催化亚基中的PIK3CD mRNA和蛋白的表达呈时间依赖性升高。结论 AECs中Ⅰ型PI3K亚基、Ⅱ型PI3K亚基和Ⅲ型PI3K亚基均有不同程度表达,TGF-β1经调控PIK3CD的表达导致Ⅰ型PI3K催化亚基的构成变化。

FGF10干预PM诱导支气管上皮细胞COX2/PGE_(2)表达的分子机制

目的探讨成纤维生长因子10(FGF10)对细颗粒物(PM)诱导支气管上皮细胞表达环氧合酶2/前列腺素E_(2)(COX2/PGE_(2))的作用及其分子机制。方法雄性C57BL/6小鼠给予0.5 mg/kg FGF10腹腔注射和4.0 mg/kg PM气道滴注,构建动物模型,设置空白组、FGF10组、PM组和PM+FGF10组。获取各组肺组织并进行病理分级评分,采用Western blot法检测各组肺组织中COX2的相对表达量,采用免疫荧光法检测支气管上皮中COX2的相对表达量,采用ELISA法检测肺泡灌洗液中PGE_(2)的分泌水平。先给予5 mmol/L ERK1/2抑制剂(U0126)/PI3K抑制剂(LY294002)干预,然后10μg/L FGF10干预,最后200 mg/L PM刺激支气管上皮细胞BEAS-2B,构建细胞模型,设置空白组、PM组、PM+FGF10组、PM+FGF10+LY294002组和PM+FGF10+U0126组。采用ELISA法检测各组细胞PGE_(2)分泌水平,采用Western blot法检测各组细胞COX2的表达水平。同时进行细胞计数、线粒体功能和乳酸脱氢酶分泌分析等细胞功能检测。结果动物模型中,气道滴注PM诱导C57BL/6小鼠支气管病理形态学的改变,伴随肺泡灌洗液中PGE_(2)分泌增多(P<0.05),肺组织COX2表达升高(P<0.05),支气管上皮COX2荧光强度升高(P>0.05)。FGF10干预下,PM诱导支气管炎症和COX2/PGE_(2)表达被逆转(P<0.05)。细胞模型中,PM诱导支气管上皮细胞COX2/PGE_(2)表达水平升高(P<0.05),FGF10干预下,COX2/PGE_(2)的表达均降低(P<0.05),BEAS-2B细胞计数、线粒体功能和乳酸脱氢酶分泌等细胞功能改变(P<0.05)。就分子机制而言,LY294002和U0126逆转了FGF10对PM诱导COX2/PGE_(2)表达的调控作用(P<0.05)。结论FGF10可以调控PM对支气管上皮细胞COX2/PGE_(2)的诱导表达,其分子机制涉及MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路。

重症肺炎血清miR-147a、miR-21、CD64、APC表达及其对预后的预测价值

目的研究重症肺炎血清微小核糖核酸(miR)-147a、miR-21、簇分化抗原64(CD64)、活化蛋白C(APC)表达及其对预后的预测价值。方法选取2022年1月-2023年7月义乌市中心医院收治的64例重症肺炎患者为重症组,随机选取同期收治的普通肺炎患者71例为普通组,比较重症组和普通组血清miR-147a、miR-21、CD64、APC水平;重症肺炎患者根据住院期间预后情况分为预后不良组和良好组,比较两组血清miR-147a、miR-21、CD64、APC水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析四指标对重症肺炎患者预后的预测价值。结果重症组血清miR-147a、APC水平低于普通组,血清miR-21、CD64水平高于普通组(P<0.05)。重症肺炎患者预后不良组血清miR-147a、APC水平低于良好组,血清miR-21、CD64水平高于良好组(P<0.05)。血清miR-147a、miR-21、CD64、APC联合预测重症肺炎患者预后的曲线下面积(AUC)值高于四指标单独检测(P<0.05)。结论重症肺炎的发生可引起血清miR-147a、miR-21、CD64、APC水平明显变化,同时四指标联合可有效提高对重症肺炎患者的预测价值,值得在临床推广。

NOX-4型NADPH氧化酶在肺部疾病中的研究进展

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX-4）主要经介导活性氧簇（ROS）的产生发挥生物学作用，参与自身稳态维持、炎症免疫反应、组织修复、肿瘤恶性转化等，异常NOX-4导致的氧化应激是不同肺部疾病共同的病理生理特点。本文检索了近年来NOX-4在急性肺损伤、气道阻塞性疾病、问质性肺病、肺动脉高压和非小细胞肺癌等的文献报道，就NOX-4在不同肺部疾病中的差异调控、致病机制研究进展作一综述，以期为肺部疾病的诊治揭示新的靶点。