双委夜蛾气味结合蛋白AdisOBP6的原核表达、抗体制备及表达谱分析

【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次免疫新西兰大白兔,制备AdisOBP6抗体;采用荧光定量PCR和Western blot技术检测AdisOBP6在双委夜蛾雌雄成虫触角、不同时期精巢以及受精卵和未受精卵中的表达情况。【结果】同源建模预测显示,AdisOBP6具有6个保守半胱氨酸残基和7个α-螺旋结构,并折叠成一个结合口袋。原核表达结果显示,在20℃下0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达量最多、最稳定。4次免疫重复中,抗体效价分别超过1∶512000,1∶512000,1∶512000和1∶64000。Western blot检测获得的抗体与AdisOBP6蛋白能够特异性结合。荧光定量PCR结果显示,AdisOBP 6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的,在幼虫期精巢中AdisOBP 6就已经开始表达,在蛹期精巢中表达量低于在幼虫期的,成虫羽化后精巢中的表达量逐渐进入高峰,在未受精卵和受精卵中几乎不表达或表达量极低。Western blot分析发现,AdisOBP6蛋白也主要在精巢中表达,在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。【结论】本研究实现了AdisOBP6的原核表达,成功地制备了抗体;并证实AdisOBP6在双委夜蛾精巢中大量表达,成虫羽化后表达量达到高峰,推测AdisOBP6可能参与了授精过程。本研究结果为今后进一步研究AdisOBP6的功能奠定了基础。

双委夜蛾感觉神经元膜蛋白编码基因鉴定及组织表达谱分析

昆虫感觉神经元膜蛋白(SNMP)是至关重要的次要嗅觉蛋白,能够作为信息素识别的标记。本研究利用荧光定量PCR方法首次克隆和鉴定了双委夜蛾Athetis dissimilis的2个SNMP基因,并命名为AdisSNMP1和AdisSNMP2。序列分析表明,AdisSNMP1编码区开放阅读框长1572 bp,编码523个氨基酸;而AdisSNMP2编码区开放阅读框长1563 bp,编码520个氨基酸。这2个基因编码蛋白质为酸性,分子量约58 kD。同源性分析发现,SNMP1和AdisSNMP2之间的序列一致性极低。进化树结果也表明同目昆虫SNMP基因进化关系最近。荧光定量PCR结果显示,AdisSNMP1主要在雌雄触角中表达,而AdisSNMP2在非触角组织中也有表达。此结果为今后对双委夜蛾SNMPs基因功能的研究提供了参考。

菌株CHZ5的分离、鉴定及其聚酮合成酶基因的PCR验证

为了获得具有聚酮合成酶(PKS)活性的野生菌株并验证PKS功能基因,本研究采用组织分离技术凤丹牡丹根部组织内生菌进行了分离培养,试验共获得16株内生菌,分别编号为CHZ1~CHZ16。8株菌与芍药白粉菌病原的平板对峙试验显示,CHZ1、CHZ2、CHZ5和CHZ6菌株表现出抑菌活性,其中抑菌作用最强的是CHZ5,抑菌带宽度平均达到了9.0 mm,故将CHZ5初步定性为产聚酮合成酶活性菌株。采用PKS-Ⅰ和PKS-Ⅱ的兼并引物对CHZ5菌株PKS基因进行PCR扩增,PCR产物测序结果证实该菌株含有PKS-Ⅰ和PKS-ⅡPKS功能基因。综合CHZ5菌株的表型特征、生化特征和16S rDNA分析结果,初步将其确定为链霉菌属Streptomyces菌株,暂命名为Streptomyces sp.CHZ5。CHZ5菌株可作为牡丹病害生防菌、PKS基因簇研究、牡丹此生天然产物和专用菌肥开发等研究的良好备用材料。

产淀粉脱支酶菌株XUEX3的分离及其诱变选育

本研究以铜山烟草(中烟100)生产田根际土壤为材料,通过以支链淀粉作为碳源的固体鉴别培养基的分离培养获得3株产淀粉脱支酶菌株,将其依次编号为XUEX1、XUEX2和XUEX3,采用DNS法测定了3株菌的产酶活性,经过32 h的连续发酵,XUEX3菌株的酶活性峰值达到了16.3 U/mL,XUEX1和XUEX2的峰值均未超过9 U/mL。选取产酶活性最高的XUEX3作为出发菌株进行紫外线诱变选育。结果表明,试验获得的3个正突变菌株XUEX3-1、XUEX3-2和XUEX3-3的产淀粉脱支酶活性与出发菌株相比均有显著提高,其中XUEX3-3的HC值达到了出发菌株XUEX3的3.2倍;经过32 h的连续发酵,XUEX3-1、XUEX3-2和XUEX3-3产酶活性的峰值分别为39.7 U/mL、43.1 U/mL和35.3 U/mL;与对照相比,突变株XUEX3-2的产酶峰值出现的时间提前了4 h,XUEX3-1和XUEX3-3的则推迟了4 h,但经过连续5代的传代培养,正突变菌株XUEX3-1、XUEX3-2和XUEX3-3的遗传稳定。研究结果丰富了产淀粉脱支酶菌株的遗传资源库,为后期的应用开发提供了更多选项。