2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的探讨2型重组腺相关病毒(rAAV2)能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组(n=4)和未转染组(n=2),经X射线照射后,分别移植入经rAAV2β-珠蛋白病毒转染(MOI=50)或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠(n=2)和未转染受体小鼠(n=1)。采用RT-PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-珠蛋白基因表达。③移植后第70天处死的转染小鼠外周血中人β链/α链分别为0.328和0.325,相对未转染组0.135的比值,两者的增加百分比高达144.78%和142.54%。结论经rAAV2介导基因修饰后的重型β-地中海贫血患者造血细胞在体内可长期稳定表达正常人β-珠蛋白基因,而其分化产生的外周血人红系细胞内β-珠蛋白肽链的合成增加。

人对氧磷酶1基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的：构建带有人对氧磷酶1（hPONI）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体，并检测其转染大鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）后hPON1的表达。方法：提取流产胎儿肝脏的总RNA，RT-PCR获得cDNA，设计引物通过PCR获得PON!基因片段，将其与pGEM—TEasy载体连接，将PON1基因片段切下，插入到质粒pAAV—IRES—GFP的多克隆位点，获得质粒pAAV—PON1-IRES—GFP，经酶切和测序鉴定。包装的病毒rAAV—PON1用斑点杂交检测滴度，并用其转染EPCs检测hPON1在mRNA水平的表达。结果：pAAV—PON1-IRES-GFP酶切和测序结果完全正确。斑点杂交检测病毒的滴度为1．7×10^10g／mL，RT—PCR结果显示病毒转染EPCs后存在hPON1的表达。结论：成功构建了pAAV—PON1-IRES—GFP质粒，包装出较高滴度的rAAV—PON1，并且转染EPCs后可以检测到hPON1表达。

中国城市化进程中农村房屋拆迁存在的问题探析——以遂宁市北坝村为例

自20世纪80年代掀起改革开放这一浪潮以来,大量的农村房屋被拆迁以满足城市化进程的需要。然而,在拆迁的过程中,各种矛盾与问题也逐渐显露出来。比如,来自拆迁方的暴力恶性拆迁;来自被拆迁方的"钉子户"思想,单方面力求自身利益的最大化等等矛盾与问题。本文深入挖掘农村房屋拆迁出现的问题,并分析相关原因以及提出一些建议。

自行车为什么能前进

在我们的日常生活中,自行车是一种常见的交通工具,与其他车辆一样,自行车在受到一定动力的驱使下,其会前进。本文对自行车在行驶过程中所受到的力学进行分析,并运用力学知识来剖析自行车为什么能前进,以强化力学知识与日常生活之间的联系。

益肾通络方对肾纤维化模型大鼠肾组织转化生长因子-β1、Smad7表达的影响

目的探讨益肾通络方治疗肾纤维化的可能作用机制。方法采用阳离子牛血清白蛋白皮下和尾静脉注射建立肾纤维化大鼠模型,将造模成功的50只大鼠随机分为模型组、对照组和益肾通络方低、中、高剂量组,每组各10只,并设10只同批正常大鼠为正常组。益肾通络方低、中、高剂量组分别予益肾通络方生药4.58、9.16、18.32 g/(kg·d)灌胃,对照组以肾炎四味片1.58 g/(kg·d)灌胃,模型组和正常组以等容量(1 ml/100 g)的蒸馏水灌胃,每天灌胃1次,连续4周。采用免疫组织化学方法结合图像分析系统测定大鼠肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad7的平均灰度值、平均光密度值、阳性细胞数、阳性率,并进行相关性分析。结果光镜下模型组肾组织TGF-β1表达明显增多,Smad7表达不明显。与模型组比较,益肾通络方各剂量组和对照组肾组织TGF-β1平均灰度值、阳性率、阳性细胞数明显减少,Smad7平均灰度值、阳性率、阳性细胞数明显提高,并且以益肾通络方中、高剂量作用更明显(P<0.05或P<0.01)。相关分析显示,TGF-β1与Smad7呈线性负相关(P<0.01)。结论益肾通络方治疗肾纤维化可能机制是调节TGF-β1与Smad7的相互作用关系,促进Smad7表达,抑制TGF-β1表达。

2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血细胞中的表达

目的:探讨2型重组腺相关病毒(recombin antadeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导人β-珠蛋白基因转染地贫患者造血细胞治疗β-地中海贫血的可行性。方法:分离β41-42/β654杂合子型重型β-地贫流产胎儿造血细胞,经rAAV2-β-globin病毒转染(MOI=50)后移植入经X射线照射的BALB/c裸小鼠体内,分别于移植后14d、21d处死受体小鼠,RT-PCR及等位基因特异性PCR法检测人珠蛋白基因在受体小鼠体内的表达。结果:RT-PCR方法于3只受体小鼠骨髓样本中成功检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达,而21d处死的转染与对照小鼠外周血样本中未检测到人β-珠蛋白基因表达;等位基因特异性PCR方法在所有受体鼠体内同时检测到β41-42和β654突变基因,以及正常β-珠蛋白基因的表达,但rAAV2-β-globin转染组小鼠体内正常人β-珠蛋白基因表达水平明显高于对照组。结论:rAAV2可有效转染β41-42/β654杂合子型重型地中海贫血患者造血细胞,并通过exvivo途径介导β-珠蛋白转基因的体内表达,提高红系细胞内正常β-珠蛋白基因的表达水平。

洛伐他汀对乳腺癌干细胞的体外化疗增敏作用

目的 :本项目旨在探讨在体外实验中洛伐他汀(Lovastatin,LV)是否能够通过增加对化疗药物的敏感性而提高对乳腺癌细胞的杀伤效果。方法 :采用超低粘附悬浮培养法从MDA-MB-231细胞获得乳腺癌干细胞样细胞。用LV加或不加化疗药物在缺氧条件下对细胞进行处理。用流式细胞仪检测细胞凋亡,用化学发光法检测细胞Caspase 3/7活性,用MTT法检测细胞增殖活性。结果 :单独使用时,LV能够显著促进MDA-MB-231细胞的凋亡并增加Caspase 3/7活性,而对ER阳性的MCF-7作用不明显。与化疗药物多柔比星联合使用时,LV显著增加乳腺癌干细胞对多柔比星的敏感性。结论 :天然化合物LV在体外能够促进乳腺癌细胞凋亡并增加乳腺癌干细胞对化疗药物多柔比星的敏感性。上述研究结果为设计针对乳腺癌的治疗方案提供了一种可能的选择,其体内作用仍需进一步研究证实。