多色流式细胞术检测CHB患者外周血多重细胞因子分泌的Th细胞亚群

目的建立多色流式胞内细胞因子检测方法,明确慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)免疫清除期患者外周血Th淋巴细胞亚群细胞因子的分泌特点,探讨CHB患者多重细胞因子的表达模式。方法选取2017年3月至2017年4月就诊于首都医科大学附属北京地坛医院的CHB免疫清除期患者10例及健康对照者10例为研究对象。根据多色流式荧光搭配原则,确立外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8及细胞因子GM-CSF、TNF-α、IFN-γ的六色流式细胞配色方案。利用健康对照者外周血单个核细胞(peripheral blood mo-nonuclear cell,PBMC)调节最适检测电压及荧光补偿,明确PMAIonomycin的体外刺激方案。分离10例CHB患者外周血PBMC细胞,PMA-Ionomycin体外刺激5小时后,行多重流式细胞因子染色,利用多色流式细胞仪LSR Fortessa获取细胞,Flowjo10.0流式细胞软件分析健康对照者及CHB患者外周血Th细胞亚群胞内细胞因子共表达水平。采用Graph Pad Prism 7.0对所得数据进行统计分析。结果建立了多重细胞因子的胞内染色方案,明确了GM-CSF、TNF-α、IFN-γ在Th细胞上的共表达分析策略,确认存在分泌双重细胞因子GM-CSF^+TNF-α^+、GM-CSF^+IFN-γ^+的Th细胞亚群。通过检测CHB患者外周血样本,发现CHB患者分泌GM-CSF、GM-CSF^+TNF-α^+、GMCSF^+IFN-γ^+的Th细胞亚群百分率均显著高于健康对照组,差异具有统计学意义(t=2.576、4.208、2.671,P均<0.05)。结论建立的多色流式细胞因子胞内染色方案可用于明确CHB患者外周血分泌双重细胞因子的Th细胞亚群的分布模式;双重细胞因子分泌的Th细胞亚群的检测可能为临床上CHB患者免疫状态的评估提供可靠依据。

多色流式细胞术检测HIV/AIDS病人中的Th细胞亚群

目的建立多色流式方法,检测艾滋病病毒(HIV)感染者/艾滋病(AIDS)病人(简称HIV/AIDS病人)中的辅助性T细胞亚群。方法用3种细胞表面抗体CD3、CD4、CD8,6种细胞内因子抗体γ干扰素(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素17(IL-17)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-2、L-10,建立多色流式染色方案。根据多色流式荧光搭配原则,制定最佳配色方案。用1例HIV/AIDS病人外周血标本分别进行最适检测电压调节、荧光补偿设定、减一阴性对照(FMO对照)。确定条件后,对3例HIV/AIDS病人外周血标本进行检测分析。结果根据阴性细胞确定检测电压,用补偿微球(CompBeads)单色染色与细胞单色染色确定适宜补偿,减一阴性对照确定阴性边界,建立了九色流式方法检测HIV/AIDS病人外周血中辅助性T淋巴细胞亚群的方案,在单细胞水平同时检测多个因子。结论建立的多色流式方案可检测HIV/AIDS病人外周血中的辅助性T细胞亚群,能在单细胞水平同时检测多个因子,所需样品少,操作简便、相对快速并能准确定量。

CD38^+/^-HLA-DR^+CD8^+T淋巴细胞比例与HIV/AIDS病人免疫状态的关系

目的分析不同CD4+T淋巴细胞(简称CD4细胞)计数,血浆病毒载量(VL)水平下,艾滋病病毒(HIV)感染者/艾滋病(AIDS)病人(简称HIV/AIDS病人)CD38^+/^-HLA-DR^+CD8^+T细胞比例变化,及其与CD8+T淋巴细胞(简称CD8细胞)计数的相关性,探究CD38^+/^-HLA-DR^+CD8^+T细胞比例与HIV/AIDS病人免疫状态间的关系。方法对46例HIV/AIDS病人外周血单个核细胞进行流式染色,检测CD38^+/^-HLA-DR^+CD8^+T细胞比例。结果1)CD4细胞分组:CD4细胞<200个/μL者,CD38-HLA-DR+CD8+T细胞比例升高(P=0.02),CD38+HLA-DR+CD8+T细胞比例两组间无统计学差异(P>0.05);CD4细胞>200个/μL者,CD38-HLA-DR+CD8+T细胞比例与CD8细胞计数正性相关(r=0.36,P=0.04)。2)VL分组:两组病人CD38^+/^-HLA-DR^+CD8^+T细胞比例无统计学差异(P>0.05),且均与CD8细胞计数无相关性(P>0.05)。结论HIV/AIDS病人CD8细胞活化水平升高,与CD38+HLA-DR+CD8+T细胞相比,CD38-HLA-DR+CD8+T细胞比例更能反映HIV/AIDS病人的免疫状态。

十色流式检测HIV/AIDS患者外周血中T淋巴细胞亚群及活化状态

目的建立十色流式方案检测HIV/AIDS患者外周血中T淋巴细胞亚群及活化状态。方法按多色流式配色原则,初步确立抗人CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD25、CCR7、CD28、CD38、HLA-DR抗体及7-AAD的配色方案。采用1例HIV/AIDS患者外周血PBMC标本进行最适电压调节、荧光补偿设定和FMO对照;设定条件后,检测5例HIV/AIDS患者的外周血样本。结果建立检测人外周血中T淋巴细胞亚群及活化状态的最优十色流式染色方案,采用此方案检测5例HIV/AIDS患者外周血标本,分析T淋巴细胞各亚群比例及活化程度,发现不同细胞亚群中活化分子HLA-DR、CD38、CD28的表达模式存在显著差异。结论十色流式方案可检测HIV/AIDS患者外周血中T淋巴细胞亚群及其活化状态操作简便,结果可靠。

甲型流感病毒感染者CD160^+CD8^+T淋巴细胞亚群分析

目的研究甲型流感病毒(IAV)感染者外周血中CD160^+CD8^+T淋巴细胞亚群的特征。方法收集2018年12月至2019年3月流感季就诊于北京大学地坛医院教学医院感染二科IAV感染者共37例及同期体检的健康对照者51例,应用多色流式细胞检测平台,检测外周血不同分化阶段CD160^+CD8^+T淋巴细胞的比例。结果与健康对照相比,IAV感染者外周血T细胞中CD160^+CD8^+T细胞比例下降[24.50%(14.70%,44.10%)vs.8.85%(5.14%,18.15%)],差异有统计学意义(U=326.00、P<0.001)。IAV感染者与健康对照相比,其CD8^+T中初始T细胞(TN)[3.88%(1.28%,9.48%)vs.0.22%(0.12%,0.60%)]、中央记忆性T细胞(TCM)[8.70%(4.43%,15.80%)vs.1.51%(0.69%,2.54%)]、效应记忆性T细胞(TEM)[22.30%(13.80%,30.40%)vs.7.71%(5.23%,16.25%)]和终末效应记忆T细胞(TEMRA)[(46.99±22.91)%vs.(21.60±13.38)%]4个亚群中CD160^+细胞的比例均下降,差异有统计学意义(U=238.50、81.50、412.00,t=6.03;P均<0.001)。IAV感染者出院时较入院时CD160^+CD8^+T细胞比例上升[(8.92±7.84)%vs.(16.40±9.43)%](t=4.09、P=0.001),但仍低于正常水平[24.50%(14.70%,44.10%)vs.(16.40±9.43)%],差异有统计学意义(U=209.50、P=0.0029)。结论甲型流感病毒感染者外周血中T淋巴细胞CD160^+CD8^+T细胞亚群比例显著降低,可能是免疫失衡的重要表现。