大连地区无偿献血者隐匿性乙型肝炎病毒感染pre-S/S区基因分析

目的了解大连地区无偿献血者隐匿性肝炎乙型病毒感染(OBI)的情况和pre-S/S区基因的变异情况。方法对大连市血液中心2010年12月2日-2013年5月31日的无偿献血者血液标本进行常规ELISA(HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP)和HIV/HBV/HCV联合NAT筛查,对于单独核酸检测反应性的献血者加以跟踪或回溯,结合乙型肝炎血清学标志物的试验、鉴别试验、病毒定量试验和半巢式PCR来确定OBI,同时对OBI的pre-S/S区基因序列与对照组(HBs Ag+序列,Genbank)做比对分析。结果共筛查158 232份血液标本,确定了其中的69份OBI,流行率为1∶2 293(69/158 232)。41例OBI获得pre-S/S区基因序列:B型6例、C型34例、D型1例;与对照组相比,OBI在S区的氨基酸序列的变异明显(PB=0.013;PC=0.003),主要变异位点为B型的V14G/A、Y161F/S、V168A、P217L和C型的E2G/A/V、T118R/K/A/M、P127T/L/H/S、E164D/G、L175S、S174N。结论大连地区献血者OBI在HBV基因组S区的氨基酸序列存在多个位点的变异,这些变异与OBI的产生存在某种关系,且这种关系受基因型的影响。

利用Gibson Assembly技术构建乙型肝炎病毒1.1倍体复制子

乙型肝炎病毒(HBV)基因组各开放阅读框高度重叠,因此构建可在体外细胞模型中复制的HBV DNA质粒至少要包含1.1倍以上的HBV基因组.构建HBV1.1倍体复制子的传统克隆方法涉及多步DNA酶切/连接,操作复杂,耗时较长.本研究发展了基于新型克隆技术Gibson Assembly构建HBV1.1倍体复制子质粒的新方法,在获得HBV基因组DNA后仅需1步体外装配即可完成,利用这一方法,本研究成功从4份HBV感染者标本中获得HBV1.1倍体复制子,并通过瞬时转染Huh7细胞,证明其能够支持HBV的体外复制.本研究为从临床标本中快速获得HBV复制子克隆以研究病毒表型功能提供了更为高效的新方法.

一种现场快速型HBV基因分型方法及装置

介绍一种现场快速型HBV(乙型肝炎病毒)基因分型方法及装置,包括生物传感器与手持式荧光检测仪。为了提高检测灵敏度与准确性,采用荧光标记法。荧光检测仪采用简化方法来快速读取侧向流试纸上各测试线及质控线的信号幅值,基于预先建立的HBV基因分型模式匹配模型,实现快速分型。对48份HBV血清样本进行检测,实验结果表明,基于荧光检测仪及侧向流试纸的分型检测结果与传统核酸分析方法的分型检测结果一致,分型准确率达100%。与传统方法相比,现场快速型基因分型方法及装置可降低HBV分型检测的复杂度,缩短检测时间,降低检测成本,对乙肝个体化用药与个性化治疗具有重要意义。

1种新型国产超敏HBsAg试剂在血液筛查中的应用研究

目的对1种新型国产超敏HBsAg试剂在血液筛查中的应用进行评估。方法用考核试剂WT CLEIA分别检测WHO标准品、HBV阴性的血清、各种HBV亚型及HBsAg突变株标本以及无偿献血者标本,并与参比试剂做比较。结果 WT CLEIA对HBsAg阴性标本的检测特异性为99.81%(95%CI:99.57%～99.93%);对WHO标准品检测的分析灵敏度可达0.012 IU/mL,高于参比试剂Hepanostika HBsAg Ultra的0.05 IU/mL和Abbott Murex V3的0.1 IU/mL;对HBsAg突变株及不同亚型的检出率也高于2种参比试剂;对近5 000份标本的检测结果与参比试剂Abbott Murex V3有高度的符合率(99.60%)。结论该试剂检测性能良好,在血液筛查中有较好的应用前景。

抗PD-L1单抗的研制及其对乙型肝炎病毒的抑制效果初步研究

目的:获得具有阻断PD-1/PD-L1结合活性的Anti-PD-L1单克隆抗体,并在体内和体外模型中初步探索其应用于慢性HBV感染治疗的潜力。方法:利用大肠杆菌原核表达系统和离子交换柱层析纯化手段,表达纯化获得具有体外结合活性的人源和鼠源的PD-1/PD-L1蛋白,采用纯化后的人PD-L1蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗人PD-L1的单克隆抗体杂交瘤细胞株,基于间接化学发光免疫法评估了这些抗体与人源和鼠源重组蛋白的结合活性,并定量评估它们对PD-L1体外相互作用的阻断活性。利用慢乙肝病人PBMC体外刺激方法评估其对T细胞功能的促进作用,在HBV转基因小鼠中评估其抑制HBV的效果。结果:本研究获得了8株稳定分泌Anti-PD-L1的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中Anti-PD-L1Ab5和Ab6两株单抗与人和小鼠的PD-L1具有较强的交叉反应性,且均可阻断人和小鼠的PD-1/PD-L1结合活性。在慢乙肝病人PBMC刺激培养实验中,Ab5和Ab6可促进γ干扰素水平升高;在HBV转基因小鼠中单剂注射Ab6,48 h后血清HBV DNA水平降低20倍,血清HBs Ag水平降低至基线水平的30%。结论:获得了2株具有阻断人和小鼠PD-1/PD-L1结合活性的单克隆抗体,其在PBMC体外刺激培养系统中可促进慢乙肝病人的T细胞功能,在HBV转基因小鼠中具有显著的抗病毒效果,具备一定的治疗应用潜力。

高浓度HBsAg检测化学发光微粒子免疫分析法的建立及性能评价

目的建立定量检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的化学发光微粒子免疫分析法(CMIA),并进行性能评价。方法将小鼠特异性抗HBsAg抗体包被在磁微粒表面,结合相应HBsAg,加入吖啶酯标记的特异性抗HBsAg抗体,在磁微粒表面形成双抗体夹心免疫复合物,加入预激发液和激发液,激发复合物上的吖啶酯发出光子,光信号值与HBsAg浓度呈正比。筛选最佳反应条件,对自建CMIA检测HBsAg的性能(线性范围、检测限、精密度、干扰试验、交叉反应、稳定性及与电化学发光法的相关性和一致性)进行评价。结果磁微粒最适浓度为0.4 mg/mL,吖啶酯标记抗体的最适稀释比例为1∶200(浓度为250 ng/mL)。反应稀释液用量、最适加样量、试剂用量分别为100、20、50μL。自建CMIA检测HBsAg的线性范围为20~100000 IU/mL,最低检测限为9.9 IU/mL,批内和批间变异系数(CV)均<10.0%。血红蛋白<400 mg/L、胆红素<4 mg/L、类风湿因子<800 IU/mL、三酰甘油<2 mg/L、柠檬酸钠<22 mmol/L、乙二胺四乙酸(EDTA)<8 mmol/L对自建CMIA检测HBsAg无干扰。甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)阳性样本对自检CMIA未发生交叉反应。配制好的试剂在37℃可稳定6 d,开盖后上机(2~8℃)保存可稳定4周,2~8℃密封保存可稳定6个月。自建CMIA与电化学发光法的相关性(r=0.978,P<0.001)和一致性均良好。结论自建CMIA检测HBsAg的线性范围较宽,高浓度样本可直接检测,无需稀释,且检测性能优良,有较好的临床应用前景。

CK-MB特异性单抗的制备方法及其应用

本研究拟建立肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)特异性单克隆抗体(m Ab)的研制方法,对抗CK-MB单抗进行评价分类及性质鉴定,并初步建立CK-MB定量检测试剂。以CK-MB抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规单抗制备技术,使用间接和捕获ELISA差异筛选法筛选单抗。利用肌酸激酶同工酶(CK-MM/BB/MB)抗原对所制备单抗的抗原识别表位进行鉴定,另通过免疫印迹法及合成CK-MM、CK-BB差异性的线性表位肽鉴定对所制备的单抗进行评价分类。使用双抗体夹心ELISA方法筛选检测CK-MB抗原的配对m Ab,并初步建立CK-MB定量检测试剂。使用74例临床标本初步评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性。最终,我们成功筛选到22株稳定分泌抗CK-MB抗体的杂交瘤细胞株,这些单抗可以分为线性、偏构象的CK-MB和CK-MM或者CK-BB交叉的单抗以及与CK-MB特异反应的偏构象型单抗,并使用偏构象型单抗研制出CK-MB定量检测试剂,该试剂与罗氏试剂相关系数r达到0.930 9。综上所述,本研究建立了研制CK-MB偏构象型特异性单抗的筛选方法,通过对所筛选的单抗进行分析鉴定并建立了CK-MB定量检测试剂,与罗氏试剂检测结果符合率高。

33株抗心肌肌钙蛋白T(cTnT)的单克隆抗体制备、鉴定及应用

旨在制备抗心肌肌钙蛋白T(cTnT)的单克隆抗体(m Ab),对单抗进行初步评价鉴定,并建立(cTnT)的化学发光定量检测试剂。首先利用外购的cTnT抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规m Ab制备技术和间接ELISA法筛选m Ab,以表达和合成的cTnT片段对筛选到的m Ab进行表位鉴定。使用双抗体夹心ELISA方法筛选检测cTnT抗原的配对m Ab,并建立cTnT全自动化学发光定量检测试剂。使用220例临床标本评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性,另外使用238例临床样本和784例体检人群样本评价该试剂的临床应用。我们成功筛选到33株稳定分泌抗cTnT抗体的杂交瘤细胞株,并对单抗的表位进行初步鉴定。我们筛选到能检测10 pg/m L cTnT抗原的配对m Ab E16H8和C8G11,并使用该配对研制出全自动化学发光定量试剂。该试剂与罗氏试剂相关系数r达到0.959 9,检测一致率95%,利用该试剂盒检测临床样本灵敏度为97.5%,特异性为99.15%,99%体检人群的cTnT浓度分布小于0.080 6 ng/m L,符合WHO对急性心肌梗死的定义标准。综上,初步建立了cTnT诊断优势表位单抗,并利用这些优势表位的单抗建立全自动管式化学发光定量检测试剂,与罗氏试剂检测结果符合率高。