RT－PCR检测HCV RNA假阳性结果分析

ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ假阳性结果分析宋燕斌，崔晓红，潘卫，王锦红，戚中田丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是新近认识的一种单股正链ＲＮＡ病毒，在感染者外周血中的含量低［１］，目前认为逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＨＣＶＲＮＡ是诊断ＨＣＶ感染的最敏...

庚型肝炎病毒基因组全长cDNA的拼接及克隆

目的：构建ＧＢ病毒Ｃ／庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）基因组全长ｃＤＮＡ克隆。方法：以覆盖ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ分离株ＨＧＶ－Ｉｗ全长基因组且互相重叠的５个基因片段Ｉｗ５，Ｉｗｑ２，Ｉｗｈ６，Ｉｗ３和Ｉｗ３为起始材料，采用重叠延伸ＰＣＲ拼接和连接酶连接的方法，构建ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ克隆。结果：ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ克隆的酶切图谱与预期一致；核苷酸序列分析显示，克隆的ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ的核苷酸及推测的氨基酸序列与原ＨＧＶ－Ｉｗ序列一致。结论：ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ的克隆已经构建成功。该克隆的构建，为深入研究ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ的致病性及致病机制、复制及转录和翻译机制。

庚型肝炎病毒NS3蛋白在昆虫细胞中的表达

The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein was expressed in Sf9 insect cells and analyzed by SDS-PAGE. A protein band about Mr 43810 was demonstrated on polyacrylamide gel electrophoresis and this protein amounted to more than 30% of the total cell proteins. Recombinant NS3 protein was purified by Ni-NTA column. Western blot showed that this recombinant protein could react with GBV-C/HGV RNA positive mixed sera. The recombinant GBV-C/HGV NS3 protein could be used to detect GBV-C/HGV infection and will supply material for study of structure and function of this protein.

PCR检测丙型肝炎病毒感染各高危人群

用ＰＣＲ方法克隆了中国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者的５＇端非编码区（５＇－ｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，５＇－ＮＣＲ）序列，并根据此序列合成引物检测我国ＨＣＶ各高危感染人群的病毒复制情况，结果显示ＨＣＶＲＮＡ在慢性丙型肝炎患者的血清标本中的阳性率为８１．８％（９／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的血液透析患者血清标本中的阳性率为６３．６％（７／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的献血员血清标本中的阳性率为２０％（４／２０），在ＨＣＶ抗体阳性的肝细胞癌标本中的阳性率为１００％（５／５），在ＨＣＶ抗体阴性的肝细胞癌标本中的阳性率为３３．３％（７／２１）。表明ＨＣＶ的体内复制情况在各高危风险人群中的情况有明显差别；提示ＨＣＶ感染也是我国肝细胞癌发生的重要风险因子之一。

抗-HCV阴性献血员中丙型肝炎病毒RNA检测及序列分析

对95份抗—HCVIgG阴性献血员采用逆转录聚合酶链反应法（PCR）检测丙型肝炎病毒RNA，结果8次中有6次其检测出17份阳性标本（17／95，17．9％），复查抗—HCVIgG仍为阴性。对其中8份阳性产物中高变区1的序列分析结果表明均为不同株HCV序列．排除了PCR污染的可能性。对其中2份阳性产物测定了全序列并与HCV各基因型代表株的相应序列比较，与HCVⅡ型相应序列的核苷酸同源性为77％～79％。而与HCVⅠ、Ⅲ、Ⅳ相应序列间的同源性为62％～69％，表明为HCVⅡ型序列。结果提示献血员抗—HCVIgG筛选不能完全排除HCV感染者，漏检不是由于HCV基因序列变异．而是检测方法本身缺陷所致。

庚型肝炎病毒NS5非结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的： 研制特异的抗ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ抗体诊断试剂。方法： ＰＣＲ扩增ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＮＳ５ 基因片段并定向克隆至转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ，转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞，３７℃振荡培养４ ｈ 使发生转座，于三抗选择平皿筛选重组ｂａｃｍ ｉｄ。脂质体介导转染ｓｆ９ 细胞，将转染上清再次感染ｓｆ９ 细胞，以批量表达ＮＳ５重组蛋白。利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法分析、检测重组蛋白。结果： 序列测定证实克隆的基因片段是ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ 的ＮＳ５ 基因片段，且阅读框架正确。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量４．１５×１０４ 处有重组蛋白的表达条带，薄层扫描占总蛋白量的１１．７％ 。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 发现重组蛋白可与ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＲＮＡ阳性患者混合血清发生较强的免疫反应。结论： ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＮＳ５ 重组蛋白可以用于ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ感染的检测。

戊型肝炎病毒合成肽决定簇检测抗HEV的研究

利用３段分别代表ＨＥＶ３个基因区的合成多肽，研制成ＥＬＩＳＡ抗ＨＥＶ检测试剂。此试剂对ＩｇＧ及ＩｇＭ检出阳性率在急性ＮＡＮＢＮＣ肝炎患者中分别为５４．１％（５３／９８）和３３．７％（３３／９８），在其他疾病患者及正常献血员中则分别为２．７％～６．３％和０％～２．６％。与Ｇｅｎｅｌａｂｓ重组抗原生产的检测试剂比较，两者有很好的一致性，其阳性符合率为９０．０％，阴性符合率为９８．５％，总符合率为９７．４％。对于急性戊型肝炎患者动态监测，７～２０ｄ内大部分患者能检出抗ＨＥＶＩｇＧ或ＩｇＭ。这些结果表明，利用ＨＥＶ合成肽能特异地检测戊肝病毒感染者的抗ＨＥＶＩｇＧ及ＩｇＭ，有助于临床诊断及流行病学调查。

Genotyping of hepatitis C virus in patients with hepatocellular carcino Ma

Forty-two patients with hepatocellular carcinoma (HCC) were examined for hepatitis C virus (HCV) RNA in liver tissues by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) with primers deduced from 5'-non-coding region (5'-NCR). HCV liver samples of

Detection of anti-HEV by synthetic peptides

Three synthetic peptides representing distinct antigenic epitopes from three genomic regions of hepatitis E virus (HEV) were used to develop enzyme-linked immunoserbent assay ELISA for detecting antibodies to HEV. Both IgG and IgM antibodies to HEV were d

慢性肝炎和肝癌病人血清中乙型肝炎病毒DNA的检测

为了了解慢性肝炎和肝癌病人患者体内乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）复制与ＨＢＶ血清标志之间的关系，用酶联免疫吸附实验（ＥＬＩＳＡ）、聚合酶链反应（ＰＣＲ）及斑点杂交方法对６１例慢性肝炎和４７例肝癌患者的ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、相关ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、表面抗体（抗－ＨＢｓ）、核心抗体（抗－ＨＢｃ）、相关ｅ抗体（抗－ＨＢｅ）进行了检测。结果表明：ＨＢＶＤＮＡ在ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、／抗－ＨＢｃ阳性的慢性肝炎和肝癌患者血清中的检出率分别为９０．５０％和５０．００％；在ＨＢｓＡｇ／抗－ＨＢｅ、抗－ＨＢｃ阳性者的检出率分别为４５．４０％和７．１４％；在ＨＢｓＡｇ阳性、ＨＢｅＡｇ阴性／抗－ＨＢｅ阴性者中的检出率分别为６０．００％和４０．００％；ＨＢｓＡｇ阴性、／抗－ＨＢｃ阳性或／抗－ＨＢｅ阳性或／抗－ＨＢｓ阳性者中的检出率分别为２０．００％和２２．２２％；在血清学指标全阴性时，慢性肝炎和肝癌患者血清中ＨＢＶＤＮＡ的检出率均为０。实验提示：无论是肝炎或肝癌，在ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ同时阳性时，ＨＢＶ复制最为活跃；在单独ＨＢｓＡｇ阳性时，ＨＢＶ有一定程度的复制；ＨＢＶ复制在肝癌细胞中受到一定程度的抑制。

丙型肝炎病毒感染者中抗病毒IgM检测的意义

建立了抗ＨＣＶＩｇＭ间接ＥＬＩＳＡ方法，并用之检测ＨＣＶ不同感染人群。抗ＨＣＶＩｇＭ在不同感染人群中的检出率变化很大。急性输血后丙型肝炎患者检出率可高达９３．８％，而正常献血员中可低至０．６８％。比较抗ＨＣＶＩｇＭ和抗ＬｇＧ阳性中ＨＣＶＲＮＡ的检测结果发现，抗ＩｇＭ阳性者中，不同ＨＣＶ感染人群的ＨＣＶＲＮＡ检出率很高（９３．０％～１００％）；而ＩｇＧ阳性者中ＨＣＶＲＮＡ的检出率变化很大（３７．５％～９３．８％）。在４３例血液透析者中抗ＩｇＭ与ＨＣＶＲＮＡ检测的一致性为８３．７％；抗ＩｇＭ与抗ＩｇＧ检测的一致性为８８．４％，结果提示：（１）抗ＨＣＶＩｇＭ与ＨＣＶ活跃复制有关，（２）抗ＨＣＶＩｇＭ与抗ＨＣＶＩｇＧ检出不完全一致。因此，临床检测抗ＨＣＶＩｇＭ有其特殊意义。

庚型肝炎病毒NS3蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 获取具备免疫反应原性的庚型肝炎病毒ＮＳ３ 抗原。方法 从重组质粒Ｉｗｑ２利用ＰＣＲ 反应扩增出ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 基因片段，克隆至表达载体ｐＰＲＯＥＸ ＨＴａ 后进行核苷酸序列测定，待鉴定正确后经ＩＰＴＧ 诱导重组工程菌，用ＳＤＳＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 对重组蛋白进行鉴定。结果 酶切鉴定和核苷酸序列测定结果表明成功地构建了重组工程菌ｐＨＴＮＳ３／ ＤＨ５α且克隆的基因片段为ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 基因片段。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析诱导表达产物发现在相对分子质量约４３ ８１０处有一条明显的蛋白表达带，占菌体总量的１７ ．７ ％ 。用ＮｉＮＴＡ 亲和层析柱快捷地获得了纯化的重组蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定发现重组蛋白可与ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＲＮＡ 阳性病人血清发生抗原抗体反应。结论 获得了具备免疫反应原性的ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 抗原，该重组蛋白可用于ＧＢＶＣ／ＨＧＶ 感染的检测。

人工合成戊型肝炎病毒抗原多肽片段的特性研究

利用固相合成肽法,参照计算机对戊肝病毒抗原结构的模拟分析,自行选择合成了7个HEV肽段,分别为EH174,EH370,EH362,EH352,EH232,EH286和EH276。建立检测戊型肝炎病毒抗体(抗HEV)的酶联免疫测定法(ELISA),检测合成肽段与戊肝患者血清的反应性,结果表明:(1)多肽抗原EH362,EH370抗体检出率为86.7％,EH286和EH276的检出率分别为46.7％和26.7％;(2)多肽抗原专一性强,与正常人血清、正常小鼠血清及单纯甲型、乙型、丙型肝炎抗体阳性血清无交叉免疫反应;(3)与88份曾经Generabs药盒检测抗-HEV的血清对照比较检测,该ELISA法与Genelabs药盒的结果符合率为95.5％。对合成肽段进行分子修饰和化学处理。大大提高合成肽与戊肝患者血清的敏感度和反应率。为合成肽用于建立对戊肝感染进行特异诊断的ELISA法提供了有利的条件。