磷酸二酯酶PA4781对铜绿假单胞菌运动能力及毒力的影响

目的探讨磷酸二酯酶PA4781对细菌运动能力及毒力的影响。方法通过测量菌苔的直径检测细菌的运动能力,利用刚果红染色和苯酚-硫酸显色法检测细菌生物膜分泌胞外多糖的能力。通过实时荧光定量PCR检测介导蹭行运动的基因PilZ、与胞外多糖合成有关的基因PelA以及控制绿脓菌素的基因PhzM的mRNA表达量。利用琼脂糖凝胶电泳检测细菌不同时间段内产生的胞外DNA量,通过测量菌斑在牛奶平板中透明圈的直径检测胞外蛋白酶的总活性。结果相比于PA03野生型菌株,PA4781敲除菌株的运动能力及PilZ的mRNA表达量降低,PA4781过表达菌株的运动能力及PilZ的mRNA表达量增高,差异均有统计学意义(均P<0.05);相比于PA03野生型菌株,PA4781敲除菌株分泌的胞外多糖及PelA的mRNA表达量增多,PA4781过表达菌株分泌的胞外多糖及PelA的mRNA表达量减少,差异均有统计学意义(均P<0.05);PA4781敲除菌株和PA4781过表达菌株的胞外DNA分泌量、绿脓菌素基因PhzM的表达量及胞外蛋白酶的水解能力均低于PA03野生型菌株,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论PA4781可能通过促进基因PilZ的表达,从而促进铜绿假单胞菌的运动能力。PA4781可能通过抑制基因PelA的表达,抑制胞外多糖的分泌。同时,PA4781可能不直接影响胞外DNA分泌量,毒力因子绿脓菌素和胞外蛋白酶的产生。

MAPK1基因沉默对肺癌A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinases1,MAPK1)基因沉默对肺癌A549细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法利用CRISPR/CAS9基因编辑技术构建MAPK1沉默细胞系,采用Real-time PCR和Western blot检测沉默MAPK1后mRNA和蛋白表达水平。将MAPK1沉默载体与空载体转染至肺癌A549细胞中,并分为MAPK1沉默组、空载体组和空白组。对各组的肺癌A549细胞进行培养,利用CCK-8实验检测细胞增殖能力;平板集落形成实验检测细胞集落形成能力;平板划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡和周期情况以及Western blot实验检测MAPK1沉默后ERK/mTOR通路蛋白表达。结果Real-time PCR和Western blot结果表明成功构建肺癌A549细胞MAPK1沉默细胞系。MAPK1沉默使肺癌A549细胞增殖能力减弱(P<0.05),迁移和侵袭能力降低(P<0.05),细胞凋亡率增加且细胞周期被阻滞于S期(P<0.05)。MAPK1沉默后,ERK/mTOR通路信号分子mTOR、PRAS40、EIF4EBP1、MEK2的总蛋白和磷酸化蛋白表达均降低(P均<0.05)。结论沉默MAPK1可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期。