Lgals3在分枝杆菌感染与肉芽肿形成过程中的作用及机制研究

目的:研究宿主Lgals3分子在分枝杆菌感染与肉芽肿形成过程中的作用及机制。方法:检测Lgals3在H37Rv气溶胶感染的小鼠、家兔肺组织及临床结核病(TB)患者样本中的表达与分布;运用CRISPR/Cas9技术构建lgals3基因全身敲除(lgals3^(−/−))小鼠,并建立lgals3^(−/−)小鼠海分枝杆菌(Mm)尾静脉感染模型,观察小鼠尾组织损伤与脓肿形成,比较尾部大体病变;HE染色观察小鼠尾组织病理学变化及肉芽肿形成差异;抗酸染色观察细菌分布;小鼠尾组织匀浆铺板接种于7H10-OADC培养基后比较菌载量;免疫组化和图像分析技术观察比较小鼠尾组织中Lgals3和TGF-β、MMP-9的表达与分布。结果:H37Rv气溶胶感染的小鼠、兔子肺组织及临床结核患者肉芽肿区域中Lgals3呈强阳性表达。应用CRISPR/Cas9技术成功获得lgals3^(−/−)小鼠;Mm感染后,lgals3^(+/+)小鼠尾组织出现明显的渐进性脓肿及溃疡,而lgals3^(−/−)小鼠仅出现散在的小面积脓肿,且差异具有统计学意义(P<0.01)。HE染色观察发现lgals3^(+/+)小鼠感染Mm后伴随明显炎症细胞浸润,且形成典型肉芽肿样病变,而lgals3^(−/−)小鼠仅有少量炎症细胞分布。组织匀浆铺板计数发现,相较于lgals3^(+/+)小鼠,lgals3^(−/−)小鼠菌载量显著降低(P<0.01)。免疫组化和图像分析技术发现,lgals3^(+/+)小鼠感染Mm后Lgals3在肉芽肿区域内呈弥散分布,TGF-β和MMP-9表达上调并呈强阳性表达;lgals3^(−/−)小鼠仅检测到少量TGF-β和MMP-9。结论:Mm感染可诱导宿主Lgals3的表达,并在TGF-β和MMP-9协同作用下促进肉芽肿形成,帮助细菌逃避早期宿主免疫应答。

利用CRISPR/Cas9技术构建Fbxw7敲低的Raw264.7稳定细胞株及其生理功能检测

目的:应用CRISPR/Cas9技术构建Fbxw7表达抑制的Raw264.7稳定巨噬细胞株,并检测其生理功能。方法:转染Fbxw7_Cas9KO质粒到Raw264.7细胞,用含嘌呤霉素的培养基培养,挑取单克隆并筛选带荧光标记的细胞进一步培养;然后采用qRT-PCR和Western blot分别检测Fbxw7基因与蛋白表达水平;Confocal进一步检测Fbxw7蛋白表达分布;测序分析基因突变情况;CCK-8和流式细胞术分别检测Fbxw7基因敲低后Raw264.7细胞增殖能力与凋亡率。结果:Fbxw7敲低组的mRNA和蛋白表达水平较正常Raw264.7细胞显著降低,Confocal观察发现敲低组Raw264.7细胞中Fbxw7蛋白表达微弱;测序结果显示Fbxw7敲低组存在多位点突变;Fbxw7敲低后Raw264.7细胞增殖能力明显降低,凋亡率增加。结论:利用CRISPR/Cas9技术可以实现Fbxw7基因在Raw264.7细胞稳定低表达,所筛选出的稳定细胞株可用于后续细胞水平的实验研究。

25-羟基胆固醇的免疫调控作用及其对结核肉芽肿形成的意义

胆固醇25-羟化酶(CH25H)是一种内质网相关酶,可氧化胆固醇生成25-羟基胆固醇(25HC)。25HC是巨噬细胞产生并分泌的唯一氧固醇,在不同生物学过程中发挥重要免疫作用,包括抗病毒效应、炎症反应、信号转导等。研究发现体内25HC高表达或体外经25HC处理均能诱导巨噬细胞泡沫化。肉芽肿是结核分枝杆菌感染后形成的特征性标志物,大量研究证实泡沫细胞参与肉芽肿形成的全过程,但CH25H/25HC通路及其介导巨噬细胞泡沫化在结核肉芽肿发生发展中的作用尚未见报道。本文将对25HC的免疫调控进展进行讨论,并重点探究25HC在结核肉芽肿形成过程中的作用,以期为研究结核病发病机制与治疗的研究提供新线索。

Tet1对海分枝杆菌感染过程中宿主炎症反应及肥大细胞活化的影响

目的:探讨Tet1分子在海分枝杆菌(Mm)感染小鼠过程中对宿主炎症反应及肥大细胞活化的影响。方法:SPF级Tet1野生型(Tet1^(+/+))和Tet1基因敲除小鼠(Tet1^(-/-))尾静脉接种相同数量的Mm,建立小鼠尾静脉感染模型。观察记录小鼠尾部大体病变,取鼠尾组织匀浆铺板培养比较菌载量;HE染色观察组织病理学变化,抗酸染色检测细菌分布;甲苯胺蓝染色观察小鼠尾组织中肥大细胞的分布及形态差异;免疫组化检测肥大细胞活化标志物类胰蛋白酶和5羟色胺(5-HT)的表达及分布差异。结果:尾静脉接种Mm后,Tet1^(+/+)小鼠尾组织出现渐进性脓肿和明显溃烂,而Tet1^(-/-)组小鼠尾巴仅发生散在性小面积肿胀;菌落计数发现Tet1^(+/+)小鼠细菌负荷逐渐增加,而Tet1^(-/-)小鼠菌载量显著降低(P<0.01);组织病理学观察发现,Tet1^(+/+)小鼠尾组织中大量炎症细胞浸润,表皮及真皮层胶原纤维断裂,且形成肉芽肿样病变,而Tet1^(-/-)小鼠镜下观察仅有炎症细胞散在分布;抗酸染色可见红色杆菌分布;甲苯胺蓝染色观察Tet1^(-/-)小鼠大多数肥大细胞结构完整,而Tet1^(+/+)小鼠尾组织中大量肥大细胞不完整且有颗粒物质释放;免疫组化染色发现类胰蛋白酶和5-HT的表达在Tet1^(+/+)小鼠中明显增加,而在Tet1^(-/-)小鼠尾组织中阳性信号很弱。结论:Tet1缺失可降低肥大细胞的活化与脱颗粒,并缓解Mm感染介导的炎症反应及组织病理损伤。

Tet1对宿主抗海分枝杆菌感染的意义与机制研究

目的探讨宿主Tet1(ten-eleven translocation)分子在抗海分枝杆菌感染过程中的意义与初步机制。方法SPF级野生型C57BL/6和Tet1基因敲除小鼠(Tet1KO)分别尾静脉接种海分枝杆菌,建立尾静脉感染模型。首先观察比较大体病变如尾巴脓肿形成及面积差异;再用苏木精-伊红染色法染色及透射电镜观察小鼠尾组织病理学变化与差异;免疫组化检测小鼠尾组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β(TGF-β)的表达与分布;组织研磨涂抹于7H10固体培养基,计数菌落并统计差异;最后,提取尾组织蛋白,Western blot检测NF-κBp65和TGF-β的表达。结果C57BL/6小鼠感染海分枝杆菌后尾巴上形成明显的脓肿、溃疡等病变;而Tet1KO小鼠病变较轻,仅出现散在的小脓肿,并且尾组织菌载量明显降低。组织病理学观察发现感染海分枝杆菌后,C57BL/6小鼠尾组织中有明显的炎性细胞聚集和浸润,形成肉芽肿样病灶,而Tet1KO小鼠尾组织中无明显炎性细胞浸润;免疫组化检测发现Tet1KO小鼠尾组织中的TNF-α和TGF-β的表达量均比C57BL/6组降低;Western blot检测发现Tet1KO小鼠尾组织中磷酸化NF-κBp65和TGF-β蛋白表达水平显著降低。结论Tet1缺失可以降低海分枝杆菌介导的炎性损伤,且利于宿主对细菌的清除。