Bcl-2家族促凋亡蛋白Bim在骨改建中的作用及调节

骨改建是由骨吸收与骨形成精密控制的生理过程,其中破骨细胞、成骨细胞分别是骨吸收、骨形成的功能细胞。生理状态下成骨细胞形成新骨与破骨细胞吸收旧骨处于平衡稳定状态,病理状态下成骨细胞和(或)破骨细胞的凋亡异常影响骨改建。Bcl-2 interacting mediator of cell death(Bim)作为内在凋亡通路上Bcl-2家族促凋亡蛋白,在骨改建中发挥重要作用。该文就Bim在成骨细胞及破骨细胞凋亡过程中表达、调节及骨改建中的作用予以综述。

牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中促凋亡蛋白Bad的表达改变

目的:检测牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中Bad的表达改变,为保护成骨细胞提供依据。方法:8.348U/L牙龈蛋白酶处理成骨细胞0、4、8、16、24、48和72h,或将不同浓度牙龈蛋白酶与成骨细胞作用24h后,蛋白质印迹法检测Bad蛋白表达改变。结果:在一定范围内,牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡中呈时间和剂量依赖性上调Bad的表达,牙龈蛋白酶抑制剂TLCK有效抑制牙龈蛋白酶所诱导的Bad的高表达。结论:牙龈蛋白酶上调Bad的表达,促凋亡蛋白Bad参与了牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡过程。

连翘苷对变异链球菌生物膜的抑制作用研究

目的探讨连翘苷对变异链球菌生物膜的抑制作用。方法采用液体二倍稀释法确定连翘苷对变异链球菌的最低抑菌浓度(MIC);采用结晶紫(CV)染色法和激光共聚焦显微镜(CLSM)测定连翘苷对变异链球菌生物膜形成的抑制作用,并计算最低生物膜抑制浓度(MBIC50);采用CLSM测定连翘苷对变异链球菌胞外多糖生成的抑制作用和对变异链球菌成熟生物膜的消解作用。结果连翘苷对变异链球菌的MIC为2 g/L;连翘苷明显抑制变异链球菌生物膜的形成且生物膜中死菌比例增加(P<0.05),MBIC50为1 g/L;1、2、4 g/L连翘苷组变异链球菌胞外多糖生成量低于阴性对照组(P<0.05);2、4 g/L连翘苷组对变异链球菌成熟生物膜具有消解作用。结论连翘苷显著抑制变异链球菌的生长、生物膜的形成及产胞外多糖能力,并且对成熟生物膜也有一定的消解作用。

BMP-7在牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中的保护作用

目的:研究牙龈蛋白酶对成骨细胞MC3T3-E1的增殖及凋亡的作用,以及BMP-7在此过程中的保护作用。方法:分离提纯牙龈蛋白酶,建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型,使用MTT法、TUNEL/DAPI染色法检测牙龈蛋白酶对成骨细胞增殖及凋亡的影响,并且研究BMP-7对于牙龈蛋白酶造成的细胞凋亡的保护作用。结果:牙龈蛋白酶呈剂量和时间依赖性地抑制成骨细胞增殖,诱导成骨细胞凋亡。在500和1000 ng/ml浓度范围内,BMP-7呈剂量依赖性地减轻牙龈蛋白酶对成骨细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用。结论:BMP-7能有效抵抗牙龈蛋白酶诱导产生的成骨细胞增殖抑制及细胞凋亡。

牙龈卟啉单胞菌W83牙龈蛋白酶的提取、鉴定及对人成骨细胞增殖、凋亡的影响

目的研究提纯并鉴定牙龈卟啉单胞菌(P.g)W83牙龈蛋白酶的方法,探讨牙龈蛋白酶对人成骨细胞系hFOB增殖及凋亡的影响。方法丙酮沉淀P.gW83上清,经重悬、透析、超滤提取牙龈蛋白酶;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离牙龈蛋白酶条带;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱/源后衰变法(MALDI-TOF-MS/MS+MS)鉴定牙龈蛋白酶提取物;底物发色法测定牙龈蛋白酶活性;牙龈蛋白酶与人成骨细胞系hFOB1.19共培养,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或CCK-8检测细胞凋亡或增殖。结果 P.gW83牙龈蛋白酶提取物经SDS-PAGE分离出50kDa蛋白条带,MALDI-TOF-MS/MS+MS鉴定其为精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Rgps)。底物发色法测定Rgps、赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Kgp)活性分别为75.62、10.51U/L,5mmol/L半胱氨酸蛋白酶抑制剂TLCK对Rgps、Kgp活性抑制分别为99.51%、99.00%(P<0.01)。牙龈蛋白酶(Rgps活性15.12U/L、Kgp活性2.10U/L)与hFOB共培养8h可诱导细胞发生凋亡,出现典型的细胞核染色质凝聚,且随时间增加hFOB凋亡率逐渐上升,16～24h达到高峰。CCK-8法检测显示,牙龈蛋白酶呈时间依赖性抑制hFOB增殖。结论丙酮沉淀P.gW83上清,经重悬、透析、超滤提纯的牙龈蛋白酶主要成分是Rgps;底物发色法测定Rgps/Kgp活性,方法稳定、可靠;牙龈蛋白酶抑制hFOB增殖且促进凋亡。

促凋亡蛋白Bim、Bax和Bak在牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中的表达

目的建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型，检测成骨细胞凋亡过程中与Bc｜-2蛋白相互作用的细胞死亡调解子（Bcl-2 interacting mediator，Bim）、Bcl-2蛋白相关X蛋白（Bcl-2associated X protein，Bax）和Bcl-2蛋白拮抗剂（Bcl-2 antagonist／killer，Bak）的表达，探寻保护成骨细胞的方法，为牙周炎的发病机制研究提供依据。方法提取牙龈蛋白酶并测定其活性；将0．453、0．906、1．812U／L牙龈蛋白酶分别与成骨细胞共培养0、16、24和48h，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色及膜联蛋白V-碘化丙啶双染色检测牙龈蛋白酶诱导成骨细胞（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14）凋亡，建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型；1．812U／L牙龈蛋白酶与成骨细胞共培养0、4、8、16、24和48h，蛋白质印迹法确定成骨细胞凋亡过程中Bim、Bax、Bak的蛋白表达；胰蛋白酶抑制剂抑制1．812U／L牙龈蛋白酶活性后与成骨细胞共培养24h，蛋白质印迹法检测Bim蛋白表达与成骨细胞凋亡率的改变。结果精氨酸-牙龈蛋白酶活性为（18．11±2．11）U／L，赖氨酸-牙龈蛋白酶活性为（1．02±0．25）U／L；DAPI染色显示1．812U／L牙龈蛋白酶可诱导成骨细胞凋亡，16h凋亡率为（6．31±0．37）％，24h达（11．20±0．35）％，48h为（10．80±0．46）％；膜联蛋白V-碘化丙啶染色结果与DAPI染色结果基本-致。成骨细胞凋亡过程伴随促凋亡蛋白Bim的表达升高，4h时Bim相对蛋白表达量为（0．31±0．03），约为对照组（0．17±0．03）的2倍，24h时Bim相对蛋白达峰值（0．57±0．05），为对照组的3～4倍；胰蛋白酶抑制剂可有效抑制牙龈蛋白酶活性，使Bim蛋白表达量由（0．58±0．04）降至（0．14±0．03）；同时DAPI染色显示胰蛋白酶抑制剂可逆转牙龈蛋白酶诱导的细胞凋亡，24h成骨细胞凋亡率由（11．20±0．35）％降至（4．31±0．38）％。成骨细胞高表达Bax（相对蛋白表达量为0．85±0．05），在成骨细胞凋亡过程中，Bax的相埘蛋白表达总量无明显改变；蛋白质印迹法未检测到成骨细胞表达Bak。结论1．812U／L牙龈蛋向酶可诱导成骨细胞凋亡，凋亡过程中伴随Bim表达升高．抑制牙龈蛋白酶活性可有效降低Bim的蛋白表达，提示促凋亡蛋白Bim参与牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡过程，抑制Bim的表达可使成骨细胞免于凋亡。

牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡过程中对整合素α5、β1表达的影响

目的探讨牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡过程中对整合素α5、β1的调节机制，为牙周炎发病机制的研究提供理论依据。方法标准厌氧环境下培养牙龈卟啉单胞菌W83，分离提纯牙龈蛋白酶。用8．348U／L牙龈蛋白酶处理小鼠成骨细胞MC3T3-E148h，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法4’，6-二脒基．2一苯基吲哚[transferase—mediateddeoxyuridinetriphosphate—biotinnickendlabeling-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidinedihydrochloride，TUNEL—DAPI]双染色法检测细胞凋亡；蛋白质印迹法检测整合素α5、β1蛋白的表达水平。结果精氨酸．蛋白酶活性为（41．74±2．11）U／L，赖氨酸一蛋白酶活性为（1．02±0．25）U／L。TUNEL—DAPI染色显示牙龈蛋白酶作用于MC3T3一E1细胞48h后诱导细胞发生凋亡。在短时间内（≤72h）牙龈蛋白酶呈时间依赖性下调整合素α5、β1的表达水平，48h时整合素α5、β1相对表达量分别为（0．485±0．039）、（0．504±0．002），72h时分别为（0．398±0．058）、（0．179±0．001），与对照组（蛋白相对表达量分别为1．000±0．000、1．000±0．000）相比差异均有统计学意义（P〈0．05）；72h后，整合素α5表达水平与对照组相比差异无统计学意义，但整合素B1仍持续下调（96、120h时相对表达量分别为0．604±0．003、0．357±0．002），均显著低于对照组（1．000±0．000）（P〈0．05）。牙龈蛋白酶特异性抑制剂甲苯磺酰．L．赖氨酰．氯甲基酮（tosyl．CL—clysine-chloromethyl—ketone，TLCK）可有效抑制蛋白酶活性，使整合素α5、β1蛋白表达量分别从（0．398士0．058）、（0．179±0．001）显著上升至（0．7814-0．012）、（0．857±0．060）（P〈0．05），但TLCK本身不改变整合素α5、β1的表达水平（P〉0．05）。同时牙龈蛋白酶还呈剂量依赖性下调整合索α5、β1的表达水平，20．8700U／L牙龈蛋白酶作用下整合素α5、B1相对表达量达最低值（0．105±0．004、0．0204-0．000），与对照组（1．000±0．000）相比差异有统计学意义（P〈0．05）。牙龈蛋白酶直接处理成骨细胞膜蛋白提取物，与对照组相比各组间整合素α5 β1相对表达量差异无统计学意义（P〉0．05），提示牙龈蛋白酶不直接降解整合素α5、β1结论牙龈蛋白酶在诱导成骨细胞凋亡过程中呈时间和剂量依赖下调整合素α5、β1的表达，下调途径不是通过该蛋白酶的直接蛋白水解发挥作用。