幽门螺杆菌与胃上皮细胞不同作用时间点蛋白质组的差异分析

目的:分析幽门螺杆菌(Hpylori)与人胃腺癌上皮细胞(humangastric adenocarcinoma epithelial,AGS)的相互作用蛋白质组学差异.方法:采用双向凝胶电泳分离Hpylori26695株与AGS细胞相互作用0.5、2、4h时间点的细胞和黏附菌的全蛋白样品,考马斯亮兰染色,ImageMster2D图像分析软件比较分析,识别差异蛋白,将差异蛋白点进行胶内酶解,经基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)获得肽质量指纹图谱(PMF),通过搜寻蛋白质数据库完成对差异蛋白的鉴定.结果:对0.5、2、4h时间点图谱差异蛋白点分析共发现主要差异蛋白点66个,对其中34个(共对应16种蛋白)最终完成准确鉴定,2h后8种蛋白开始上调,其中2种是细胞来源,6种Hpylori来源;4h时4种细胞来源蛋白下调,并有4种新的蛋白开始被观察到.在共感染的早期,细胞的琥珀酸脱氢酶、Hpylori的抗氧化酶类、黏附素以及HSP60表达上调.感染晚期主要是细胞来源的亲环素A、新生多肽相关复合物α多肽开始表达,Hpylori来源的尿素酶、非血红素铁蛋白等蛋白明显出现在黏附菌成分中.结论:Hpylori与AGS细胞相互作用过程中,细菌和细胞蛋白表达均存在明显时序性变化,早期相互作用则主要表现为以与黏附等有关的蛋白表达变化,后期向有利细菌存活和增殖的方向发展,并呈现出与免疫逃逸和病理损伤相关的变化.

幽门螺杆菌实验室长期传代cagA启动子的进化

目的:评价实验室长期多次传代对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)标准菌株26695 cagA启动子基因稳定性的影响.方法:PCR方法扩增54个不同批次保存的经过多次传代的H.pylori 26695克隆子的cagA启动子,并进行测序,使用Vector NTI Suite 6软件比对序列.结果:54个H.pylori 26695克隆子的cagA启动子序列有22个(40.74%)与NCBI公布的序列完全一致,32个(59.26%)在不同位点发生碱基置换、缺失、插入等突变,其中第17位碱基有5个(15.63%)发生T→C突变,第199位碱基有14个(43.75%)发生A→C的变异,在159-160重复碱基A处有12个(37.5%)发生缺失1个或者2个A,还有一个多出2个A.结论:长期多次传代会导致H.pylori cagA启动子突变,实验室使用标准菌株要注意传代记录,建立不同等级实验室质控,根据使用标准菌株研究内容的水平决定实验室质控的等级.

Claudin在幽门螺杆菌和AGS细胞相互作用不同时间点表达分析

目的研究Claudin家族成员在Helicobacter pylori(H.pylori)和AGS相互作用的不同时间点表达谱变化。方法TRIzol方法提取H.pylori26695攻击AGS细胞0、0.5、2、4、6 h时间点的细胞总RNA样品,对样品mRNA进行线性扩增后,应用IlluminaHuman-6芯片检测基因表达量,以Detection Score≥0.99;|DiffScore|≥13;方差分析(ANOVA)P≤0.05作为筛选差异基因的标准;比较Claudin家族成员的表达量。结果Claudin家族有4个成员存在差异表达,其中在早期Claudin 15下调,4 h后无差异,Claudin 2、23早期上调后于4 h和6 h分别恢复至无差异水平,而Claudin 6在0.5 h后持续上调。结论Claudin蛋白家族2、6、15、23成员参与H.pylori感染过程,并且呈现时序性变化,为H.pylori感染能引发胃癌机制研究提供线索。

人乳头瘤病毒16型L1/E7嵌合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的 克隆人乳头状瘤病毒16型（HPV16）L1／E7嵌合蛋白基因，并在毕赤酵母中表达。方法 PCR扩增HPV16L1／E7基因，并克隆至毕赤酵母表达载体pPIC-3．5K和pPIC-9K中，构建含HPV16L1／E7基因的pPIC3．5K—HPV16L1／E7和pPIC9K—HPV16L1／E7重组表达载体，经测序证实插入的外源基因读码框正确后，分别转入GS115和KM71菌株中，筛选阳性转化菌株，经PCR鉴定，甲醇诱导表达HPV16L1／E7嵌合蛋白，经SDS—PAGE和Western blot鉴定，电镜观察，并经离心法纯化VLPs。结果 HPV16LI／E7基因已成功插入pPIC-3．5K和pPIC-9K载体中，共获得6株KM71HPV16L1／E7-pPIC3．5K、5铢GS115HPV16L1／E7-pPIC3．5K、1株KM71HPV16L1／E7-pPIC9K和2株GS115HPV16L1／E7-pPIC9K阳性转化菌株，并可表达相对分子质量约为69000的蛋白，与预期值一致。表达量约为0．35～1．04mg／ml。Western blot显示该蛋白可与抗-HPV16L1蛋白和抗-HPV16E7蛋白的单克隆抗体特异性结合。在透射电镜下可观察到VLPs的形成，其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。经纯化的目的蛋白纯度接近100％。结论 已成功构建了pPIC3．5K—HPV16L1／E7和pPIC9K—HPV16L1／E7重组表达载体，阳性转化菌株可表达结构与野生型HPV16一致的VLPs。

北京市朝阳区食物中毒相关金黄色葡萄球菌病原学分析

目的了解2017年北京市朝阳区11株食物中毒相关金黄色葡萄球耐药性、耐药基因、毒力基因及分子分型。方法依据GB4789.10-2016对甲、乙饭店留样食品、餐具及厨师手涂抹样品进行金黄色葡萄球菌分离鉴定;荧光定量PCR法检测耐药基因mecA、vanA与毒力基因sea、seb、sec、sed、see;纸片法与微量肉汤稀释法进行药物敏感性试验;脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)进行溯源分析。结果甲、乙饭店留样食品、餐具涂抹及厨师手涂抹样品共检出11株金黄色葡萄球菌。耐药基因mecA、vanA与毒力基因sea、seb、sec、sed、see均未检出。检出菌株对青霉素100%耐药,四环素、氯霉素耐药率分别为27.3%、9.09%,未发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株。PFGE分型显示,甲饭店餐具涂抹菌株、手涂抹菌株及乙饭店所有菌株可为3种带型。结论甲乙饭店分别为两起由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件,皆为携带菌株的厨师污染餐具及食品引起,菌株具有较高耐药性。

居民冰箱食源性致病菌病原学分析

目的了解北京市朝阳区居民冰箱卫生状况及食源性致病菌耐药与毒力分析。方法采集居民冰箱拭子进行大肠菌群、葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定;分离菌株采用微量肉汤稀释法、纸片法及PCR法进行耐药及毒力研究。结果 120件棉签拭子,大肠菌群、葡萄球菌阳性率48.33%(58/120)、49.17%(59/120),金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性率2.50%(3/120)、1.67%(2/120),未检出单核细胞增生李斯特氏菌。金黄色葡萄球菌红霉素耐药率33.33%(1/3);凝固酶阴性葡萄球菌青霉素、红霉素耐药率23.21%(13/56)、21.43%(12/56)。小肠结肠耶尔森氏菌头孢唑林耐药率50%(1/2)。金黄色葡萄球菌毒力基因seb阳性率66.67%(2/3),sea、sec、sed、see与耐药基因mec A、van A阴性;凝固酶阴性葡萄球菌mec A阳性率1.69%(1/59),sea、seb、sec、sed、see、van A阴性。小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因ail、yst A、vir F、yad A阴性,yst B阳性。结论北京市朝阳区居民冰箱卫生状况差,存在食源性疾病传播风险,应加强冰箱正确使用宣传教育。

CagA对AGS细胞Ca^(2+)相关蛋白磷酸化的影响

目的:分析幽门螺杆菌(Hpylori)细胞毒素相关蛋白A(CagA)对人胃腺癌黏膜上皮细胞(AGS)Ca2+相关蛋白磷酸化的影响,进一步揭示Hpylori的致病机制.方法:采用金属离子亲和吸附富集技术富集Hpylori、Hpylori CagA缺失株(Hpylori△CagA)与AGS细胞相互作用4h,以及培养相同时间的AGS细胞的磷酸化蛋白,利用二维凝胶电泳技术分离磷酸化蛋白,ImageMaster 2D分析软件识别差异蛋白,MALDI-TOF/TOF质谱鉴定确认蛋白.结果:Hpylori△CagA作用的AGS细胞,与培养相同时间的AGS细胞比较表达量不变,而Hpylori△CagA作用的AGS细胞表达量发生了明显变化,表明此蛋白的变化是单纯由CagA引起的;此类蛋白点共鉴定出19个,其中3个蛋白点与Ca2+相关.钙离子结合蛋白(nucleobindin-2 precursor,CALNUC)在AGS细胞以及Hpylori△CagA与AGS相互作用的2-D胶中表达量接近,而Hpylori与AGS相互作用后该蛋白表达量明显降低.结论:Hpylori CagA进入AGS细胞可能会影响内质网、线粒体及高尔基体的钙稳态,诱发内质网、线粒体、高尔基体凋亡或增殖途径,而成为胃炎、胃溃疡、胃癌发生的诱因之一.

枸杞对小鼠骨髓细胞增殖和白细胞介素-1的影响

目的 :观察枸杞对小鼠造血功能和 IL -1产生的影响。方法 :用 10 0 %枸杞浸出液给小白鼠连续灌胃 10 d,1次 /d,检测小鼠骨髓细胞增殖反应、IL-1产生。结果 :枸杞组对骨髓细胞增殖反应明显增强 ,与对照组相比有非常显著性差异 (P<0 .0 1) ,而枸杞组 IL-1与对照组相比无显著性差异 (P>0 .0 5 )。结论 :枸杞可促进小鼠骨髓细胞增殖反应 ,而对

建立膜抗原荧光抗体试验评价北京株冻干水痘疫苗免疫效果

为了建立用于水痘疫苗接种后血清中特异性抗体检测的膜抗原荧光抗体(FAMA)法,并对接种水痘疫苗后儿童血清中水痘特异性抗体进行检测,评价北京株水痘疫苗的免疫效果。以水痘带状疱疹病毒(VZV)感染细胞作为抗原制备成固定抗原玻片,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG作为二抗建立FAMA法,并对该法的敏感性、特异性进行验证。运用此法对不同剂量北京株水痘疫苗接种后儿童血清中特异性抗体进行检测,分析儿童血清中水痘特异性抗体水平以及免后抗体阳转率,并与Oka株水痘疫苗进行比较。结果显示,FAMA法敏感性可达0.0196IU/ml,特异性好。应用此法检测300名观察者免前免后双份血清样本中抗VZVIgG,易感者中北京株水痘疫苗原苗(39810PFU/0.5ml)、2000PFU/0.5ml、500PFU/0.5ml接种组儿童血清免后抗体阳转率分别为100%、98.77%、85.42%,抗体几何平均滴度(GMT)分别为36.4、34.3、18.6,原苗与2000PFU间的抗体阳转率和GMT均无显著性差异(P>0.05),但原苗与500PFU、2000PFU与500PFU间的抗体阳转率和GMT均有显著性差异(P<0.05)。对照国产、进口Oka株水痘疫苗接种后抗体阳转率分别为95.35%、96.97%,抗体GMT分别为13.3、16.0,不同剂量北京株疫苗抗体阳转率与国产、进口Oka株疫苗相比,差别无显著性(P>0.05),但北京株疫苗原?

PCR检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因

目的:检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因谱携带情况,探讨与食物中毒发病相关的金黄色葡萄球菌基因类型。方法:取食品中检出的金黄色葡萄球菌进行分离培养鉴定,通过PCR技术检测样本18种不同型的肠毒素基因的携带情况,并进行统计学分析。结果:食品中检出的金黄色葡萄球菌肠毒素基因有较高的阳性检出率,主要检出sea、seb、sei、seg、sel、sem、sen等基因,其中sea基因检出率最高,达到77.27%;sei、seg、sem、sen基因具有相关性,检出率为9.09%;seb、sel基因的检出率为4.55%。结论:在食品中主要检出金黄色葡萄球菌肠毒素sea、sei、seg、sem、sen、seb、sel等基因,其中,sei、seg、sem、sen基因的相关性还有待进一步深入研究。

单克隆抗体2E6对大鼠脑缺血组织AChE的特异性标示

目的 :建立特异性检测中枢胆碱能神经AChE的新方法。方法 :复制大鼠局灶性脑缺血模型 ,用抗乙酰胆碱酯酶 (AChE)单克隆抗体 2E6对脑缺血不同时点脑组织AChE进行定量检测及免疫组化研究。结果 :缺血侧脑组织重量与AChE含量呈正相关。AChE水平在缺血 0 5h明显升高 (P <0 0 5 ) ,1h - 2h维持相对稳定状态 ,从 3h起显著升高 ,12h达高峰 ,此时 ,脑神经细胞胞浆及胞膜AChE标记阳性。结论 :2E6可用于AChE的定量检测及特异性标示 ,为研究胆碱能神经的病理生理学变化提供了新方法。

幽门螺杆菌CagA对AGS细胞RNA转录相关磷酸化蛋白的影响

目的研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)细胞毒素相关蛋白A(CagA)作用后人胃腺癌上皮细胞(AGS)RNA转录相关蛋白磷酸化的变化情况,进一步揭示CagA的致病机制,为寻找生物标记蛋白奠定基础。方法采用金属离子亲和吸附富集技术富集H.pylori、H.pyloriCagA缺失株(H.pylori△CagA)与AGS细胞相互作用4 h、以及培养相同时间的AGS细胞的磷酸化蛋白,利用二维凝胶电泳技术分离磷酸化蛋白,ImageMaster2D分析软件比较分析识别差异蛋白,4700型MALDI源蛋白分析器确认蛋白。结果CagA致使AGS细胞的7个RNA相关的磷酸化蛋白出现差异表达,其中1个磷酸化蛋白表达量上调、4个磷酸化蛋白表达量下调、2个新出现磷酸化的蛋白。hnRNP D0 127位的苏氨酸及137位的丝氨酸发生了磷酸化。结论CagA作用后,致使hnRNP D0蛋白磷酸化。AGS细胞与RNA转录相关蛋白磷酸化的变化,呈现出诱导细胞凋亡、增殖及有利于细胞免疫逃逸的趋势。

缺血时间对脑缺血再灌注损伤及脑组织AChE表达的影响

目的 :研究不同的缺血时间再灌注 0 .5 h对脑缺血组织的损伤程度及乙酰胆碱酯酶 ( ACh E)的影响。方法 :建立大鼠局灶性脑缺血动物模型 ,制备并纯化抗神经系统 ACh E的单克隆抗体 2 E6,观察缺血再灌注脑组织的病理变化及 ACh E含量。结果 :不同缺血时间再灌注 ,脑组织的损伤程度不同 ,ACh E的变化亦不同。结论 :单克隆抗体 2 E6可以用于神经系统 ACh E含量的检测 ,ACh

柠檬酸杆菌属基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图谱库的扩展及效果评价

目的扩展基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)中柠檬酸杆菌属数据库。方法采用PCR方法扩增并测序管家基因leuS进行系统发育分析鉴定菌种;采用平行对照实验优化菌株培养和样品制备条件;按照自建库方法手动采集优化培养后的菌株谱图,构建实验室内部数据库,并进行灵敏度与特异度评价。结果经系统发育分析,有7个种共66株柠檬酸杆菌。最佳培养条件为哥伦比亚血平板做培养基、转种1次、培养24 h,甲酸溶液体积25μL。新增沃克曼氏柠檬酸杆菌和巴氏柠檬酸杆菌2个菌种谱图,补充中国株弗氏、布氏、吉氏、杨氏、无丙二酸柠檬酸杆菌等5个菌种本地区谱图。结论leuS基因可以有效区分柠檬酸杆菌属菌种,MALDI-TOF图谱库的扩展提升了质谱对本地区柠檬酸杆菌属菌种鉴定准确性。

人胃上皮细胞中幽门螺杆菌CagA相关未知磷酸化蛋白和磷酸化位点分析

背景：细胞毒素相关基因A蛋白（CagA）是Ⅰ型幽门螺杆菌（H.pylori）的主要毒力因子。H.pylori胃癌、胃炎相关株和CagA缺失（△CagA）株的蛋白质组学研究尚未发现CagA相关生物标记蛋白。目的：分析H.pyloriCagA阳性株和△CagA株作用后人胃上皮细胞中差异表达的未知磷酸化蛋白和磷酸化位点,为研究CagA的致病机制提供线索。方法：以金属离子亲和吸附富集技术富集经H.pylori标准株和△CagA株作用4h的人胃腺癌细胞株AGS的磷酸化蛋白,双向电泳（2-DE）分离蛋白,飞行时间质谱（TOF-MS）技术鉴定差异蛋白点。结果：H.pylori标准株作用后,AGS细胞FAM50A蛋白276位丝氨酸发生磷酸化,PQBP1蛋白227～251序列中有磷酸化位点。与H.pylori标准株相比,△CagA株作用于AGS细胞可引起至少13种未知磷酸化蛋白的变化,其质谱图中均出现中性丢失峰,其中2种表达量增加,4种表达量降低,6种消失,1种新发生磷酸化。结论：CagA阳性H.pylori感染可致AGS细胞FAM50A和PQBP1蛋白发生磷酸化。所发现的13种未知磷酸化蛋白为揭示CagA的致病机制提供了线索。

2009—2020年北京市朝阳区113株食源性金黄色葡萄球菌耐甲氧西林和肠毒素/类肠毒素基因携带与分子分型分析

目的了解北京市朝阳区2009—2020年113株食源性金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药、肠毒素/类肠毒素基因携带和分子分型情况。方法采用纸片扩散法进行头孢西丁药物敏感性实验,结合mec A基因扩增鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA);实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,QR-PCR)检测28种金黄色葡萄球菌肠毒素/类肠毒素(staphylococcal enterotoxins/enterotoxin-likes,SEs/SEls)基因;采用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)进行分子分型。结果检出7株MRSA(6.19%、7/113);所有菌株至少携带1种肠毒素/类肠毒素基因,最多携带14种,共检出24种肠毒素/类肠毒素基因;经典sea~see肠毒素基因携带率为0%~33.63%。MLST共24型,ST1、ST398、ST7、ST59为优势型;发现ST6656、ST6688、ST6709、ST6745、ST67545个新型别。PFGE共分25型,H型(11/113)、I型(9/113)、J型(29/113)是优势分型,占比43.36%。结论本地区食源性金黄色葡萄球菌MRSA菌株分离率低于临床株;PFGE分型结果中J、H、I 3种优势型占比近半,显示本地区食源性金黄色葡萄球菌优势菌株集中;优势ST型别主要与医院、社区感染和动物相关。新发现5个ST型别;肠毒素/类肠毒素携带与ST型别存在一定关联性;ST1-MSSA-sea-seh-sek-seq-selw-selx是优势株;仅检测5种经典肠毒素不能代表金黄色葡萄球菌引起食物中毒的致病因子,应扩大肠毒素检测范围。

金黄色葡萄球菌肠毒素与多位点序列分型分子分型研究进展

金黄色葡萄球菌肠毒素是金黄色葡萄球菌引起食物中毒的重要毒力因子,目前已发现27种金黄色葡萄球菌肠毒素/类肠毒素,不同来源的金黄色葡萄球菌携带的肠毒素/类肠毒素存在差异,且有研究发现肠毒素/类肠毒素与猩红热、全身感染等临床疾病关系密切。致病能力较强的金黄色葡萄球菌已在全球各地形成具有独特优势的区域克隆型,多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)作为一门新兴的监测细菌遗传进化趋势的分子分型技术,是目前描述金黄色葡萄球菌全球流行情况的主要分子分型方式。遗传基因与毒力基因的联合检测是监测菌株流行传播趋势、评估致病能力的重要实验室方法。肠毒素/类肠毒对部分ST分型的致病能力起决定性作用,遗传基因与毒力基因作为参与菌体不同表达调控的重要因子,二者影响菌株致病能力的相关报道提示金黄色葡萄球菌可能存在未被关注的新致病机制。本文围绕不同来源金黄色葡萄球菌的肠毒素/类肠毒素携带情况、分子分型特征及二者对金黄色葡萄球菌致病能力的关联研究进行综述。

2020年1~3月北京市朝阳区412例监测人群29种呼吸道多病原谱分析

目的:了解2020年1~3月北京市朝阳区监测人群29种呼吸道病原感染情况。方法:采集412例监测人员呼吸道标本并提取核酸,使用实时荧光定量PCR同时检测29种呼吸道病原体。单因素分析使χ2检验或Fisher确切概率法,检验水准为α = 0.05,统计软件为SPSS 26.0。结果:412份标本中病原体阳性检出率62.38% (257/412),其中细菌、病毒、非典型病原体阳性检出率分别为37.38% (154/412)、21.12% (87/412)、35.92% (148/412)。不同年龄段多病原体检出率具有统计学意义差异,99份标本显示混合感染24.03% (99/412),非典型病原体合并细菌检出率57.58% (57/99)、新型冠状病毒合并其他病原体感染占44.44% (44/99)。结论:北京市朝阳区2020年1~3月412例监测人群29种呼吸道多病原谱以真菌、新型冠状病毒、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌为主;不同年龄段病原体检出率具有差异;混合感染多非典型病原体合并细菌为主。

结核分枝杆菌耐药性检测技术研究进展

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的一种危害人类健康的慢性传染病,是我国面临的重要公共卫生问题之一。近年来,结核病在我国总体呈现稳步上升的态势,疾病负担日益增加。MTB耐药,尤其是多重耐药、广泛耐药,是结核病临床治疗面临的主要问题,MTB耐药性检测已成为结核病临床治疗、监测的关键性问题。目前MTB耐药检测方法主要有表型检测、分子检测以及新型检测技术。本研究对现有MTB耐药性检测的技术方法进行综述,为结核分枝杆菌耐药性检测新型技术的开发提供参考。