长效人白细胞介素4拮抗剂的研究

目的研制保留白细胞介素4受体(IL-4R)结合能力,但不具有激活下游信号活性的人白细胞介素4(IL-4)突变体M5,并通过抗体Fc融合延长其体内半衰期,为变态反应病药物研发提供基础。方法全基因合成人IL-4突变体M5,将其克隆到p BV220表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达M5蛋白。同时构建嵌合基因M5-Ig G1Fc,并克隆到p PICZαA载体中,电转化糖基工程毕赤酵母GJK01,经甲醇诱导,分泌表达M5-Ig G1Fc融合蛋白。利用CTLL-2/IL-4R细胞测定纯化所得M5蛋白、M5-Ig G1Fc融合蛋白的IL-4拮抗活性,最后利用ELISA试剂盒检测比较两者在小鼠体内的清除速度。结果由大肠杆菌DH5α表达的M5蛋白和糖基工程酵母GJK01表达的M5-Ig G1Fc融合蛋白都具有IL-4拮抗活性,它们在CTLL-2/IL-4R细胞上拮抗IL-4(5.6×10-2nmol/ml)的EC50分别为(0.31±0.05)和(0.77±0.03)nmol/ml。小鼠体内M5蛋白在注射后0.5 h时达峰,其在血液中的含量为5.8×10-2nmol/ml,而在2 h时血药浓度已下降为峰值的2.8%,在8 h时低于ELISA试剂盒的检测限。M5-Ig G1Fc融合蛋白在注射后0.5 h时血液中浓度也达到峰值,为4.7×10-2nmol/ml,120 h时其血药浓度下降为峰值的4.3%,而168 h时低于ELISA试剂盒的检测限。结论 M5蛋白具有IL-4拮抗作用。由糖基工程酵母表达的M5-Ig G1Fc融合蛋白不仅具有IL-4拮抗活性,而且在小鼠体内具有较长的半衰期,为下一步将其研发为治疗变态反应病的药物提供了理论基础。

Endo-H在毕赤酵母中的表达、纯化及其在N-糖基化分析中的应用

目的通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H(endo-beta-N-acetylglucosaminidase H,Endo-H),并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)Endo-H的cDNA序列,设计并合成Endo-H全基因,将其克隆至P.pastoris表达载体pPIC9中,重组质粒转化P.pastoris JC308宿主菌,工程菌经甲醇诱导,分泌表达Endo-H,目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后,纯度可>95%。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳(DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis,DSA-FACE)分析核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNaseB)的糖基结构,比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F(peptide-N-asparigine amidase F,PNGase F)的糖基切割功能。结果利用P.pastoris表达制备EndoH,可切割天然或变性状态下的β-1,4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链,不能切割复杂型糖链糖蛋白;经DSAFACE分析,结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5GlcNAc-Man9GlcNAc,PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5GlcNAc2-Man9GlcNAc2,两者相差一个GlcNAc。结论通过P.pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性,可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。

过表达N-糖基转移酶的糖基工程酵母构建

目的通过过表达N-糖基转移酶,构建1株糖基化修饰效率更高的糖基工程酵母。方法利用尿嘧啶(URA3)营养缺陷型筛选标记,在糖基工程酵母4-32中转入醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)启动子控制的利士曼原虫N-糖基转移酶星状孢子素和温度敏感性酶3(staurosporine and temperature sensitivity 3,STT3)D亚基,通过SDS-PAGE、Western印迹和肽N-糖苷酶F(peptide-N-asparigineamidase F,PNGase F)酶切等方法,分析4-32-STT3D表达的抗人表皮生长因子受体2(HER2)抗体(anti-human epidermal growth factor receptor 2)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)N-糖基化程度,并测定STT3D转入和诱导表达对酵母生长情况的影响。结果 SDS-PAGE结果显示,4-32-HL菌表达的抗HER2抗体除有一条相对分子质量约55×103的重链主带外,还有一条约50×103的未糖基化条带。4-32-HL-STT3D菌表达为均一的55×103条带,无50×103条带。PNGase F酶切后,上述重链呈50×103的均一条带。Western印迹证明以上所有条带均为抗体成分。以GM-CSF作为报告蛋白验证STT3D的作用,结果显示,4-32-GM-CSF菌表达的GM-CSF为22×103和20×103的两条带,而4-32-GM-CSF-STT3D表达则为均一的22×103条带。PNGase F酶切4-32-GM-CSF和4-32-GM-CSF-STT3D菌表达的GM-CSF后,GM-CSF呈18×103的均一条带。分别测定STT3D外源基因转入和诱导表达时对酵母生长情况的影响,统计学分析显示,STT3D转入不诱导对酵母生长影响不显著,STT3D诱导表达对酵母生长影响极显著。结论过表达N-糖基转移酶的糖基工程酵母对靶标蛋白具有更高的N-糖基化修饰效率。