解淀粉芽孢杆菌胞外多糖发酵条件的优化

解淀粉芽孢杆菌PB6可以生产胞外多糖,通过单因素和响应面实验,对其进行发酵优化研究。实验结果表明,最优发酵培养基:蔗糖浓度400g/L、酵母粉2.5g/L、Na Cl 10g/L、p H7.0;发酵条件为:接种量4%、温度30℃、转速150r/min、发酵时间26h。在此条件下发酵的解淀粉芽孢杆菌胞外多糖的产量可高达104.37g/L。

枯草芽孢杆菌B6的特性及其对哺乳期母猪生产性能的影响

文章旨在报道一株极具益生菌开发潜力的枯草芽孢杆菌B6,通过实验确定了该菌株高产功能性果聚糖的最佳碳源为蔗糖,果聚糖作为B.subtilis B6的主要功能性代谢产物,其胞外产量在100 g/l以上,经实验验证,该菌株产生的果聚糖具有很强的抗氧化作用,10 mg/ml果聚糖的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分别为80%和71%以上,铁还原能力达到43.26 mmol/g FeSO4当量。B.subtilis B6显示了活菌数高,菌种性能强,生产成本低等优良的应用特性。哺乳期母猪的饲喂效果显示B.subtilis B6液体菌剂可使仔猪平均窝重提高28.8%,平均断奶窝重提高18%,显著提高母猪及仔猪免疫力。综上,菌株B.subtilis B6作为特效益生菌在饲料添加剂领域将具有很大的开发潜能和市场价值。

植物乳杆菌CGMCC.5297产细菌素条件的优化及应用

用响应面法对植物乳杆菌CGMCC.5297生产细菌素的培养基进行了优化。通过Plackett-Burman设计和中心组合试验设计,植物乳杆菌CGMCC.5297代谢产细菌素的最佳培养条件为酵母粉5.09g/L,牛肉膏10.85g/L,葡萄糖55.34g/L。此时的细菌素上清与指示菌单核细胞增多性李斯特菌CVCC1595共培养4h后,指示菌OD600nm为0.001 73,效价为4499 IU/mL,提高了1.4倍。在最优发酵条件下获得的试验结果与模型预测值吻合,说明所建立的模型是切实可行的。将优化后的植物乳杆菌上清加入到自制酸奶中,发现此细菌素对酸奶具有良好的保鲜效果。

木聚糖酶XynG1-1在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

将来源于Paenibacillus campinasensis G1-1的木聚糖酶编码基因成功整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建了高产木聚糖酶XynG1-1的毕赤酵母工程菌。采用响应面法对该工程菌的发酵条件进行优化。首先使用Design-Expert软件进行Plackett Burman实验设计筛选出影响产酶量的3个主要因素,即甲醇含量、生物素含量和培养时间。在此基础上使用Design-Expert软件进行Box-Behnken实验设计,通过响应面分析得出优化的发酵培养条件为:甲醇含量2.28%,培养时间37.29 h,生物素4 mg/L,酵母粉20 g/L,蛋白胨20 g/L,YNB 30 g/L,装液量100 m L/L,转速250 r/min、温度28℃、磷酸缓冲液pH 6.0。经实验验证,优化后的培养条件下胞外重组酶活达到707.2 IU/m L,与响应面预测结果一致,较优化前木聚糖酶酶活提高了7.9倍,较原始菌株产酶量提高了19.8倍。经10 L发酵罐扩大培养之后,重组木聚糖酶的酶活达到2 703 IU/m L。因此,该研究有效提高了木聚糖酶XynG1-1的发酵产量,并且,该重组酶保持了良好的酶学性质,可为工业化生产及应用奠定基础。

耐热普鲁兰酶CBM68结构域中关键位点对其酶学性质的影响

通过对Anoxybacillus sp.LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(Pul A)与麦芽三糖共结晶的晶体结构分析,在新命名的底物结合域CBM68中预测出4个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62和R96),分别将4个氨基酸位点突变为丙氨酸,得到突变体Pul A^(Y14A)、Pul A^(D16A)、Pul A^(K62A)和Pul A^(R96A)。其中,突变酶Pul A^(Y14A)和Pul A^(R96A)的底物结合力及催化效率与野生酶Pul A相比均有明显降低,其K_m值分别比Pul A提高了4.2倍和2.5倍,k_(cat)/K_m分别为Pul A的29%和37%。同时,Pul A^(Y14A)和Pul A^(R96A)的最适作用温度均降低了10℃,Pul A^(R96A)的最适作用p H也降低了0.5个单位。说明Y14和R96是CBM68结构域中的关键氨基酸位点,这两个位点的发现为进一步探究CBM68结构域的作用机制奠定了基础。

实验室芽孢杆菌菌种库中高产蛋白酶、糖基转移酶菌株的测定与筛选

该研究以实验室前期构建的小型芽孢杆菌菌种库中的335株芽孢杆菌菌株为研究对象,通过测定其产蛋白酶和糖基转移酶的特性挖掘到蛋白酶缺陷菌株68株、产中性蛋白酶菌株185株、产碱性蛋白酶菌株217株和具较强蛋白分泌能力的菌株87株。经进一步筛选获得22株高产碱性蛋白酶菌株和12株高产中性蛋白酶菌株;另外,基于此菌株资源库,同时进行了产新型糖基转移酶的菌株筛选,以甜菊苷为底物,得到了13株底物转化率达50%以上的菌株,其中菌株BAP#和114#的转化产物分别被鉴定为莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷E。综上可见,实验室的芽孢杆菌菌株资源库虽然规模较小,但无论是对于常用工业酶制剂的开发,还是对于新型食品用酶的定向挖掘,都提供了丰富和多样的菌种资源,显示了很好的菌种筛选应用前景。

甜蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达及应用

巴西甜蛋白(Brazzein)是分离自非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon果实中的一种天然高倍甜味蛋白,具有较好的食品应用潜力.利用毕赤酵母GS115对巴西甜蛋白及蛋白二硫键异构酶(protein di-sulfide isomerase,PDI)进行共表达,重组Brazzein在发酵液中分泌表达量为1 g/L.采用超滤-纳滤膜分离系统和冷冻干燥技术开发重组Brazzein的低成本制备工艺,并完成口感评价,甜度倍数为蔗糖的40倍.同时研究了重组Brazzein对常见致病菌和肠道益生菌的体外抑菌性能,结果表明,重组Brazzein对白念珠菌的最低抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为15 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC值为7.5 mg/mL,对桧状青霉的MIC值为3.75 mg/mL,对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌没有发现明显的抑菌效果.该研究为Brazzein在甜味剂方面的推广应用提供了理论研究基础.

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.nigerCBS513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。

一株产耐热普鲁兰酶菌株Anoxybacillus sp. LM14-2分离鉴定及酶学性质研究

从云南轮马热泉下游淤泥中筛选得到了一株产耐热普鲁兰酶菌株LM14-2。根据形态特征及16S rRNA序列同源性分析,初步判定为Anoxybacillus sp.LM14-2。该菌株发酵上清液中有耐热普鲁兰酶积累,其反应最适pH值为6.0,最适温度为70℃。利用染色体步移技术获得了完整的普鲁兰酶编码基因(HQ660582),经序列相似性进一步分析,确定该蛋白与I型普鲁兰酶保守区b相吻合。通常的普鲁兰酶在高温下很快失活,难以满足淀粉加工,洗涤剂等相关工业的需求,而该新型的耐热普鲁兰酶的作用温度广泛,热稳定性较好,65℃保温55 h后达到其半衰期,具有广阔的开发应用前景。

一株地衣芽孢杆菌的性质研究及发酵培养基优化

[目的]研究实验室自分离的地衣芽孢杆菌KL6作为微生物饲料添加剂的可行性,并对其发酵培养基进行优化,确定最佳培养条件,为工业化发酵提供依据。[方法]运用表型试验对其进行生理生化评价及产酶评价;运用4因素3水平正交试验和单因素试验对其培养基进行改进,并对其发酵条件进行优化。[结果]地衣芽孢杆菌KL6的D-葡萄糖产酸试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验等均呈阳性;4种因素对活菌数影响的显著性次序为:MnSO4>NaCl>酵母粉>蛋白胨,对芽孢数影响的显著性次序为:MnSO4>蛋白胨>酵罐放大培养,最佳放罐时间应在14～16 h,获得的菌体数量约101.63×109个/ml,芽孢率为97.11%。[结论]体外评价试验表明,地衣芽孢杆菌KL6具有作为微生物饲料添加剂的潜力;发酵培养基及条件优化试验表明,地衣芽孢杆菌KL6能够适于高密度液体发酵。该试验为以KL6为基础的微生物饲料添加剂的开发和大规模发酵培养提供了理论依据。

一个新型耐热普鲁兰酶的结构与功能

新型普鲁兰酶的研究对于普鲁兰酶制剂的国产化、打破国外垄断具有非常重要的意义。从我国云南腾冲地区轮马热泉的淤泥中分离获得了一株耐热普鲁兰酶产生菌LM 18-11,经16S rDNA序列系统进化树分析,确定该菌为厌氧芽胞杆菌Anoxybacillus属种,并从中克隆获得了耐热普鲁兰酶的编码基因,该酶在55℃-60℃、pH 5.6-6.4的范围内具有最大的反应活性。此外,该酶具有较好的热稳定性,在60℃下处理48 h,仍可保持50%以上的活力;动力学分析该酶的Vmax和Km分别为750 U/mg和1.47 mg/mL,是目前文献报道中比活力最高的耐热普鲁兰酶。同时还对该酶进行了晶体结构分析,结果显示该酶具有?-淀粉酶家族中典型的结构,在N端具有一个特殊的底物结合域,该结构域的缺失导致比活力和底物结合力都有相应降低,Vmax和Km分别为324 U/mg和1.95 mg/mL。同时,将该普鲁兰酶编码基因导入枯草芽胞杆菌中,在P43启动子的控制下,普鲁兰酶基因获得了高效表达,胞外酶活可达42 U/mL,相比初始菌种,表达活力提高40倍以上。研究表明该普鲁兰酶具有很好的应用前景。

工业酶与绿色生物工艺的核心技术进展

绿色生物工艺是国家战略性新兴产业,具备高效、安全、节能、环保等特点,市场前景广阔。工业酶是绿色生物工艺的“芯片”,新型高效工业酶的开发与应用相关技术是绿色生物工艺的核心。文章综述了工业酶制剂产业现状、以中国科学院天津工业生物技术研究所为代表的研发机构在工业酶及绿色生物工艺开发应用方面产生的一系列关键技术突破与研发进展,展示了通过酶与生物技术的进步提升传统加工产业发展的典型案例,随着这些核心技术的发展将推动越来越多的传统制造业走向绿色可持续发展路线。

一株植物乳杆菌所产细菌素的性质及诱变筛选

以从自制乳酪中分离获得的1株植物乳杆菌为研究对象,其能大量分泌对单核细胞增多性李斯特菌有极强烈抑制作用的细菌素。对其细菌素性质及效价进一步研究发现：所产细菌素具有热稳定性,pH稳定性,在pH2~12之间仍具有一定的抑菌活性。经过细菌素效价实验,确定该菌所产细菌素活力大大高于文献报道的其他同类细菌素,相对Nisin效价为4199 IU/mL,并可与抗生素比较效价,相对利福平效价为458μg/mL。进一步将该植物乳杆菌进行甲基磺酸乙酯（EMS）诱变,以抗生素利福平为标准曲线,最终得到细菌素上清液对单核细胞增多性李斯特菌效价由458μg/mL提高到682μg/mL,比诱变前提高了48%。

普鲁兰酶N端结构域CBM68对酶学性质的影响

碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Modules,CBMs)在普鲁兰酶结构中普遍存在,对酶的催化性质起重要作用.本文将酸性普鲁兰酶Pul B的N端结构域CBM41-X45替换成耐热普鲁兰酶Pul A的N端结构域CBM68,得到重组酶Pul-11,同时将Pul-11的催化结构域替换成Pul A的催化结构域,得到重组酶Pul-12.结果显示,重组酶Pul-11和Pul-12的最适温度均较Pul B提高了10℃,最适pH分别提高了0.5和1;60℃下热稳定性分别提高了41.4%和44.0%;同时,重组酶Pul-11和Pul-12的底物亲和力和催化效率较Pul B也均有一定程度提高.可见,来源于耐热普鲁兰酶的新型底物结构域CBM68对普鲁兰酶的最适作用温度、最适作用pH及催化效率具有重要影响.

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB)13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。

普鲁兰酶及其分泌相关蛋白的研究进展

普鲁兰酶对于以淀粉为原料的食品加工以及生物能源等工业具有重要的作用。近年来对于该工业酶的开发已经不仅仅停留于简单的新菌种筛选过程,为了完成菌株的分子改造从而提高产量以及酶学性质,对其编码基因的调控及其分泌等相关蛋白的研究则显得尤为重要。本文对这一内容的研究进展进行了系统的综述。

毕赤酵母中tRNA_(CCG)^(Pro)基因的表达及其作用效果

转运核糖核酸(tRNA)是蛋白质合成过程中重要参与成分之一,为了探索稀有密码子对应的tRNA(稀少tRNA)丰度改变对外源基因表达量的影响,文中构建了毕赤酵母稀少tRNA基因与外源基因共表达体系。首先在GFP基因中添加由4个连续脯氨酸稀有密码子CCG组成的阻遏区,结果显示该GFP基因的表达量明显降低。然后将带有阻遏区的GFP基因和tRNA_(CCG)^(Pro)基因顺次连接于pPIC9K载体上,在毕赤酵母GS115中共表达,结果使GFP表达量提高了4.9%;另将带有阻遏区的GFP基因和tRNA_(CCG)^(Pro)基因分别连接于pPIC9K和pFLDα载体,在毕赤酵母GS115中共表达,GFP表达量最高提高了12.5%;应用同样方式将tRNA_(CCG)^(Pro)基因与NFATc3T-GFP融合基因共表达,其表达量提高了21.3%。可见,tRNA_(CCG)^(Pro)在毕赤酵母GS115中确为稀少tRNA,通过共表达tRNA_(CCG)^(Pro)基因可显著提高带有连续该密码子的外源基因表达量,并且,文中构建的共表达体系将同样适用于其他稀少t RNA基因的筛选和验证。