杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列,并对其进行测序和序列分析。方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamHI、EcoRI、HindⅢ、PstI、SalⅠ及XbalⅠ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL。采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5′上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序。结果:从HL里扩出约1200bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序。该序列的3′端与已知NR基因cDNA5′端序列完全一致。该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列。结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5′上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列。

杜氏盐藻泛素基因cDNA的克隆及系统进化分析

根据玉米，水稻等物种泛素序列设计一对简并引物。提取杜氏盐藻细胞的总RNA，利用RT-PCR方法扩增盐藻泛素基因的cDNA片断，回收两个长度不同的片断ubi-1和ubi-2，将其克隆到pMD18-T载体上，测序后进行序列分析，为克隆杜氏盐藻泛素基因的cDNA序列并进行进化分析。结果ubi-1经测序后得到一个完整拷贝（228bp）和一个不完整的泛素cDNA序列（191bp）。Ubi-2经测序后得到两个拷贝（556bp）和一个不完整的泛素cDNA序列（191bp）。盐藻3个不同拷贝泛素cDNA序列之间存在差异，但所编码氨基酸序列相同。盐藻泛素cDNA序列与其他物种的泛素cDNA序列具有高的同源（70％～85％），所推导的氨基酸序列与其他物种仅存在1～2个氨基酸的差异。进化分析显示，所分离的盐藻泛素基因与两个模式生物果蝇和衣藻的泛素基因共处一个进化支．彼此亲缘关系最近。盐藻泛素基因与其他物种的泛素基因可能来自共同的“祖先”基因，在进化中高度保守。

抗草丁膦bar基因的原核表达与多克隆抗体的制备

目的:制备抗草丁膦bar基因的原核表达系统和多克隆抗体。方法:以常规基因重组技术,将bar基因片段插入原核表达载体pET28,得到重组质粒pET28-bar,经酶切、测序鉴定正确后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,镍柱亲和纯化目的蛋白,以目的蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。结果:bar基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,占总蛋白的39.2%。以高纯度的目标蛋白作为抗原免疫小鼠,得到抗PAT的抗血清。ELISA检测抗血清效价达到1:51200,Western blot检测证实抗血清能与目的蛋白特异性结合。结论:以纯化的bar基因表达蛋白PAT作为抗原,制备了特异性较高的抗PAT抗体。