胎儿睾丸组织异种移植后生精细胞发育初探

目的 :以人胎儿睾丸组织为供体 ,免疫缺陷小鼠为受体 ,研究人类睾丸生精细胞异种移植后的继续发育情况。 方法 :将 2 6周胎儿的睾丸组织植入去势裸鼠背部 ,于移植后 1 35d取出移植物 ,进行组织形态学观察 ,分析原始生精细胞在异种异位的发育情况。 结果 :移植 1 35d后取出的移植物显示 ,其生长幅度已由移植前直径约 1mm和湿重约 5mg ,分别增加到移植后大于 3mm和 2 0mg。组织形态学观察发现 ,移植前的睾丸主要是由直径为(6 0± 1 5 ) μm的精曲小管索构成 ,其中包含的细胞主要是原始Sertoli细胞和少量原始生精细胞 ,细胞排列呈弥散无规则状态 ;而移植后 1 35d的精曲小管索已发育成具有管腔的精曲小管 ,出现由Sertoli细胞和生精细胞组成的完整生精上皮 ,直径增大到 (80± 2 5 ) μm。原本呈不规则分布的原始Sertoli细胞和生精细胞大部分已迁移到基膜处 ,其中有少数生精细胞发育成为精原细胞。 结论 :人胎儿睾丸组织移植到去势裸鼠背部后 ,可以继续存活并进一步生长发育。

泰和鸡肾小球旁器的观察

本文用光镜和透射电镜对泰和鸡(乌骨鸡)的肾小球旁器进行了观察。结果表明,泰和鸡的肾小球旁器由球旁细胞、过渡型致密斑、球外间膜细胞和极周细胞所组成。极周细胞在鸟类还属首次报道,它位于肾小囊脏层与壁层上皮移行处,环绕着肾小体的血管极,其结构与哺乳动物的相似。本文还就泰和鸡肾小球旁器的结构与功能的关系作了讨论。

兔胚泡源性植入信号的在体研究模型及其初步研究

根据兔眼前房自体移植子宫内膜技术，建立了兔眼前房自体子宫内膜和异体３ｄ兔胚泡的双移植动物模型，并用该模型进行胚泡源植入信号的研究。结果表明，兔眼前房的子宫内膜受卵巢激素的调节。妊娠兔眼前房的子宜内膜受孕酮调节，呈分泌期子宫内膜。而非妊娠状态下，眼前房的子宫内膜受雌激素调节，呈增殖期状态。３ｄ胚泡易植入妊娠兔眼前房的子宫内膜，而难植入非妊娠兔眼前房的子宫内膜。胚泡植入到子宫内膜分泌细胞位置上，而不植入于纤毛细胞位置上。胚泡在眼前房内生长１６ｄ，并有部分分化的成软骨细胞和神经管结构等。眼前房水的生物化学分析表明，胚泡植入后出现一类与正常房水不同的蛋白质，并认为是胚泡诱导的蛋白质，分子量为１５８００，与白细胞介素－２有相似的泳动速度。

一种与受精有关的人精子膜蛋白（BS－17）的分离纯化

本文用盐分级分离，ＭｏｎｏＱＦＰＬＣ及ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法从人精子ＣＨＡＰＳ抽提液中分离纯化出一种与不育病人血清中抗精子抗体发生特异反应的ＢＳ－１７人精子膜蛋白。该蛋白为一糖蛋白，分子量为１７．５５±２．１５ｋＤ，等电点为５．６５，中性己糖含量为１６．６７％。在人精子上主要分布于顶体区域，不同于已有报导的人精子膜蛋白。在体外实验中抗ＢＳ－１７多克隆血清可以显著影响人精子的获能（ｐ＜０．０２５）和对去透明带仓鼠卵的穿透（ｐ＜０．００５），但不影响人精子运动性及与去透明酯酸带仓鼠卵的结合。小鼠体内被动免疫实验结果证明抗ＢＳ－１７多抗血清具有明显地抑制受精的功能（ｐ＜０．００１）。

一种与Calpastatin具有部分同源结构的人精子膜蛋白的发现与研究

在以前工作中我们从人精子中分离纯化出一种与生育有关的糖蛋白，命名为ＢＳ－１７。本文用其多克隆抗血清从人睾丸λｇｔ１１ｃＤＮＡ表达库中克隆了编码ＢＳ－１７的ｃＤＮＡ片段。序列分析表明ＢＳ－１７ｃＤＮＡ片段长７９１ｂｐ，开放阅读框架５５８ｂｐ，可编码１８６个氨基酸。经数据库检索，该ｃＤＮＡ片段与人Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ（Ｃａ￣（２＋）依赖的半胱氨酸蛋白酶ｃａｌｐａｉｎ抑制剂）基因３’端顺序具有９９．７％的同源，与Ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ蛋白质羧基末端同源性为９９．５％。用ｃＲＮＡ进行组织原位杂交结果表明，ＢＳ－１７基因表达于人精子减数分裂后期单倍精细胞阶段。

棉酚对男性精子影响的电子显微镜观察

本研究报道育龄男子服醋酸棉酚后不同时期精液中精子超微结构改变的观察结果。育龄男性志愿者每日服药剂量为20毫克,连服50天后,改服每周40毫克的维持量,共观察了服药前5例作为自身对照,他们于服药后30天和50天分别再予检查;另对服维持量第84天的7例进行了观察。精液离心之沉渣用戊二醛-锇酸固定,丙酮脱水,Epon 812包埋,电镜观察。观察结果表明,螺旋鞘膜线粒体和顶体-核帽系统是对棉酚最敏感的细胞器,出现损伤最早、最严重,轴丝体和细胞核亦有不同程度的改变。严重的可见整个精子崩溃解体,精液中出现细胞残体和大量脱落细胞。根据上述结果,对棉酚造成精子损伤的性质及其意义予以分析和讨论。

一种与不育有关的人精子蛋白质的组织特异性及表达

目的通过对已被ＧｅｎＢａｎｋ接受、编码与不育有关的人精子蛋白质的ｃＤＮＡ片段（ＢＳＤ－２．４）的组织特异性及表达阶段的研究，进一步了解其特性。方法采用Ｄｏｔｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和组织原位杂交技术。结果该ｃＤＮＡ只在人和大鼠睾丸组织中表达；在人睾丸曲细精管的精原细胞、精母细胞和精子细胞中均有转录。结论ＢＳＤ－２．４ｃＤＮＡ编码蛋白具有睾丸组织特异性，并在精子发生的各个阶段均有不同程度的表达。

大鼠睾丸Sertoli细胞内微管分布的研究

本研究应用免疫荧光和透射电镜方法,对大鼠睾丸Setroli细胞内微管的分布进行了观察。结果表明,Serto|i细胞内微管主要分布于核上方胞质内,沿细胞长轴排列,并随Sertoli细胞主干及分支伸展于各生精细胞之间,直至上皮顶部。在生精上皮周期中,伴随上皮构筑的改变及Sertoli细胞的变形,微管分布呈现规律性变化。Ⅰ～Ⅴ期长形精子细胞周围微管密集,沿细胞长轴顺行。Ⅶ期时,富含微管Sertoli细胞突起包绕于精子细胞头部周围,并将其送入和悬吊子曲管腔内,部分微管伸展方向与精子细胞头部镰状外形一致。精子释放后(Ⅷ～Ⅸ期),Sertoli细胞突起及其微管回缩;在开始伸长变形的精子细胞周围微管再次聚集。本研究结果提示,Sertoli细胞内微管分布及其规律性变化与生精上皮构筑,Sertoli细胞外形变化及精子细胞的运动和释放密切相关。

大鼠睾丸Sertoli细胞外质特化结构生后发育的超微结构观察

本研究采用透射电镜法,对生后1～8周和成年期大鼠睾丸Sertoli细胞外质特化结构(ES)的发育过程进行观察。结果表明,生后第1周ES处于初建阶段,质膜下见高电子密度物质聚集,并见有间断排列的内质网短池。第2周时微丝束开始出现,沿质膜下伸展,内质网池逐渐融合。第3周时微丝密度增加;相邻细胞膜间开始出现紧密连接。随生长发育ES亦逐渐完善,至生后第5周时已于Sertoli细胞基底部周缘广泛伸展。此后直至成年,其形态结构和分布未见有显著改变。本研究认为,大鼠在出生后5周内是ES的重要发育期,与血-睾屏障的形成和完善相一致。

抗兔附睾特异性蛋白ESP－2单克隆抗体及其抗生育研究

兔附睾液中分离纯化了两个特异性蛋白ＥＳＰ－１和２，分子量分别为４２ＫＤ和２０ＫＤ。应用基因克隆技术，又从人睾丸λ－ｇｔｌｌ表达性。ＤＮＡ基因库中筛选分离出一个１．９Ｋｂ的编码ＥＳＰ－２ｃＤＮＡ片段，为了进一步深入研究ＥＳＰ－２做为抗生育疫苗的可能性，本研究用半固体融合细胞培养基法成功地制备了抗ＥＳＰ－２的单克隆抗体，经三轮筛选后获得阳性克隆３８个，经定量分析ＯＤ值均为０．５以上，其中三株命名为ＥＳＰ－２ｍＡｌ、ＥＳＰ－２ｍＡ３和ＥＳＰ－２ｍＡ９，接种于ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠腹腔之后，腹水滴度均达１∶１００，０００。本研究采用体内外结合的被动免疫抗生育实验，即用抗体处理精子后进行体内抗生育实验，用小鼠双侧子宫互为对照和实验，证明ＥＳＰ－２ｍＡ３，ＥＳＰ－２ｍＡ９单抗对小鼠受精有明显的抑制作用，Ｐ＜０．０５和＜０．０１。对上述两株ＥＳＰ－２抗体的抗受精机理需进一步探讨。

兔附睾分泌蛋白的免疫细胞化学研究

本实验采用免疫细胞化学方法和免疫电泳转移技术,研究兔附睾蛋白ESP-1和ESP-2的分泌和定位。结果表明,ESP-1和ESP-2的分子量分别为42kd和20kd,它们在兔的睾丸、心、肺、脾、肾,胃肠道和骨骼肌,以及大鼠的睾九、附睾均为阴性。在兔的附睾中,起始段为阴性,从附睾头段开始出现阳性反应,显示ESP-1位于上皮细胞核上区,ESP-2则均匀地分布在细胞浆内。附睾体和近尾段上皮细胞呈强阳性反应。在此区内,附睾管腔内的精子和上皮表面的静纤毛亦出现强阳性反应,并一直持续到输精管。附睾远尾段、前列腺和精囊腺均为阴性。以上结果提示,ESP-1、ESP-2是兔附睾专一分泌蛋白,它们主要由附睾体的上皮细胞制造,并分泌入管腔,参与附睾液的组成,并结合到附睾精子和上皮的表面,可能参与附睾精子的成熟过程。本文还讨论了它们可能的生理意义。

用原位杂交法研究兔附睾蛋白BE－20的基因表达

兔附睾尾液经ＨＰＬＣ纯化后，获得分子量为２０ｋＤ的附睾特异蛋白，命名为ＢＥ－２０。ＢＥ－２０的抗体具有明显抑制人精子穿透去透明带仓鼠卵的能力。已获得编码ＢＥ－２０的０．５ｋｂｃＤＮＡ片段，命名为ＲＥＤ－２０。用地高辛标记此片段，与兔睾丸、附睾、输精管和肝组织进行原位杂交，观察ＢＥ－２０在各种组织中的定位和表达。采用杂交前热变性与不用热变性组织两种方法进行原位杂交。杂交信号均为紫褐色的颗粒，分布在附睾尾的主细胞和近端输精管的上皮细胞的胞质内，表明胞质内ｍＲＮＡ与地高辛标记ＲＥＤ－２０ｃＤＮＡ探针杂交。组织经热变性后，附睾尾和近端输精管上皮细胞核出现强阳性反应，表明核内的同源ＤＮＡ与地高辛标记的ＲＥＤ－２０ｃＤＮＡ探针杂交。但在睾丸和肝脏内未见杂交信号，提示ＢＥ－２０是附睾尾和近端输精管上皮细胞合成的蛋白质。经分析证明，此蛋白是一种细胞外的蛋白酶抑制剂，可能与防止精子过早获能有关，它是否能用于制备抗生育疫苗有待深入的研究。

主动免疫肌动蛋白样蛋白7a蛋白引起小鼠睾丸曲细精管的损伤

目的原核表达并纯化全长的人精子肌动蛋白样蛋白7a(ACTL7a)蛋白,检测主动免疫ACTL7a产生抗精子抗体后小鼠睾丸的损伤情况。方法构建重组表达质粒pET30a-ACTL7a,以重组质粒转化E.coli Rosseta(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过镍离子金属螯合树脂纯化和SDS-PAGE切胶分离目的蛋白,溶胶后以表达的ACTL7a蛋白免疫ICR小鼠。ELISA检测抗体效价,PAS染色检测主动免疫后曲细精管的发育。结果经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达出目的蛋白ACTL7a,纯化后免疫ICR小鼠,经PAS染色发现主动免疫ACTL7a的小鼠其睾丸曲细精管出现生精细胞脱落、核凝聚、生精细胞缺如、生精细胞退化等异常的管腔。结论成功构建了ACTL7a基因全长的原核表达载体,经诱导表达和纯化获得高纯度的目的蛋白。发现ACTL7a蛋白主动免疫ICR小鼠产生抗精子抗体后,小鼠睾丸的曲细精管发生严重损伤。

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northernblot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果(1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长1238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northernblot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northernblot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。

兔附睾蛋白的分离提纯及其免疫酶细胞化学研究

目前对精子在附睾内成熟的机制了解得很少。附睾的分泌和重吸收,为精子成熟提供了一个理想的环境。研究附睾的分泌和生理,对揭示精子成熟的机制和调节雄性生育有重要意义。我们用10%的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺垂直平板电泳,在0.025mol Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3),电流45mA,温度10℃条件下,对兔附睾尾液、头液和精子膜蛋白进行了分析。结果表明,附睾尾液约有20条多肽区带,分布在14kd和94kd分子量之间。其中有三个主要蛋白的分子量依次为67,42和20kd。用激光密度扫描仪测得它们各占附睾尾液总蛋白的32.00%,19.35%和25.80%。附睾头液和精子膜蛋白各有25条以上的区带。

编码人精子膜蛋白BS-84的cDNA研究

在以前的工作中,证实人精子膜蛋白BS-84系不育患者血清中一种重要的抗精子抗体的靶抗原,实验初步表明它与受精作用有关。由于精子材料来源的困难,严重影响了对其结构与功能的深入研究。目前应用基因工程技术获取大量精子蛋白的途径已受到重视。本工作对编码BS-84的cDNA进行了克隆筛选与鉴定,限制性酶谱分析、核苷酸序列测定及结构分析、组织特异性检查和转录水平的基因表达研究。

与不育患者血清呈特异性反应的精子细胞抗原的纯化、分布及功能研究

男性免疫避孕的关键是寻找具有高度组织特异性、与生育功能密切相关的强抗原,1975年Shulman证实存在抗精子抗体,揭示了抗精子抗体与不育间的密切联系。我们曾对300例不育患者的血清抗体进行了相应精子膜抗原的分析,其中84 ku与72 ku蛋白的出现频率极高,约占不育抗体的40％。

睾丸支持细胞的骨架和功能

Sertoli细胞自1865年被发现以来,一直被认为是男性生殖系统的重要组成部分。形态及功能的研究表明,除对生殖细胞的支持和营养外,Sertoli细胞还具有构成血—睾屏障、形成睾丸内微环境调节精子发生,吞噬细胞残体,产生类固醇类物质及分泌多种肽类物质调节生殖的功能。这使对Sertoli细胞的认识远远超出了单纯支持的概念。

大鼠睾丸精子发生中差异表达基因RSD5的克隆与表达分析

为了分离、克隆精子发生相关基因 ,深入了解精子发生的分子机理 ,本文以大鼠睾丸曲细精管显微分离结合DDRT PCR的方法 ,所得的不同区段中差异表达的EST(expressedsequencetag)筛选大鼠睾丸cDNA文库 ,获得一个新的cDNA序列 RSD5。RSD5cDNA全长 15 5 6bp ,编码 176个氨基酸 ,GenBank接收号为AF146 738。RSD5基因编码蛋白序列含有一个PEST基序 ,这是蛋白质快速降解的标志。Northernblot分析结果显示 ,RSD5在睾丸组织和脑组织表达量较高 ,且在不同发育天龄的睾丸组织中具有显著的表达差异性。RSD5基因的表达特征及其编码蛋白的PEST基序提示RSD5蛋白可能在精子发生中具有重要作用。

人月经周期子宫内膜雌、孕激素受体的变化

为了进一步了解人雌、孕激素受体(ER、PR)在子宫内膜周期性的变化,采用ABC免疫组织化学方法,测定了全切子宫组织的ER和PR。结果显示ER、PR在腺体、间质及肌层中的分布不完全相同,并呈现周期性的变化。腺上皮中PR的变化较明显,分泌晚期PR消失。间质及肌层中ER、PR的变化不如腺上皮明显,但在分布上也存在着疏密的变化。月经周期中子宫内膜ER、PR的这些变化提示:依赖于性甾休激素的组织在生长与分化中可能是通过受体的变化来调节其功能。