荷斯坦牛脐带间充质干细胞分离鉴定及分化研究

动物干细胞作为重要遗传种质资源和再生医学的可行性资源,拥有广阔研究和应用前景。对荷斯坦牛脐带细胞(umbilicalcord mesenchymalstem cells,UCMSCs)进行分离、鉴定,并对其多向分化潜能等生物学特性进行研究。取3月龄健康荷斯坦牛胎牛脐带,采用Ⅳ型胶原酶分离细胞进行体外培养,获得的细胞贴壁后呈长梭形,生长曲线呈典型的“S”形,群体倍增时间随着代次的升高逐渐下降。免疫荧光和RT-PCR的检测结果都表明,分离的细胞中CD29、CD73、CD90、CD166均阳性表达,而CD45不表达。成脂肪诱导后,可见被油红染色液染色的脂滴,成脂肪关键基因LPL和PPAR-γ都阳性表达;成骨诱导分化后,可见被茜素红染色的钙结节,其表达成骨关键基因骨桥蛋白OPN和Ⅰ型胶原蛋白基因COL-Ⅰ;成软骨诱导分化后,可见被阿利新蓝染色的软骨组织,表达成软骨细胞关键基因转录因子基因SOX9和ACAN。成功从3月胚龄的荷斯坦牛脐带中分离出其具有良好的增殖活力及成脂肪、骨和成软骨能力的间充质干细胞,可为动物种质资源保存和再生医学提供依据和潜在可利用细胞资源。

牛脂肪间充质干细胞的分离培养及分化潜能的研究

【目的】对荷斯坦牛脂肪来源的间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells, AD-MSCs)进行体外分离与培养,研究其生物学特性,为干细胞临床研究提供一种新型可用的种子细胞。【方法】无菌收集2月龄荷斯坦牛胚胎的腹股沟脂肪组织,使用Ⅰ型胶原酶消化收集细胞进行培养,使用荧光抗体技术和RT-PCR检测细胞膜表面特异性标记物(CD29、CD44、CD73、CD166、CD34、CD45),利用纯化后的细胞绘制P4、P10、P16代生长曲线并计算群体倍增时间,利用细胞克隆形成试验计算克隆形成率,染色体核型分析判断细胞遗传是否稳定,通过向AD-MSCs培养皿中添加诱导液,验证其向成脂、成骨、成软骨的分化潜能。【结果】体外分离培养的细胞呈贴壁漩涡状生长,细胞形态为长梭形。荧光抗体技术和RT-PCR检测结果表明,CD29、CD44、CD73和CD166细胞膜表面抗原被表达,CD34和CD45不被表达,确定分离的细胞为AD-MSCs。绘制的细胞生长曲线为S型,P4、P10、P16代细胞群体倍增时间分别为33、35、44 h,克隆形成率分别为(51.67±1.53)%、(38.00±2.00)%、(25.00±1.00)%,2个指标在3个代次间差异均显著(P<0.01;P<0.05)。核型结果表明,AD-MSCs为正常二倍体(2n=60,XX),染色体形态均为端着丝粒,无畸变。诱导分化结果显示,在体外AD-MSCs具有成脂、成骨、成软骨的分化潜能,分别出现明显的脂滴、钙结节和软骨团,且分别表达成脂诱导基因脂蛋白脂肪酶(LPL)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)、成骨诱导基因Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)和骨桥蛋白(OPN)、成软骨诱导基因SRY样HMG盒9(SOX-9)和软骨蛋白聚糖抗体(ACAN)。【结论】用荷斯坦牛胚胎能成功在体外分离原代AD-MSCs,细胞形态具有典型的间充质干细胞形态,具有成脂、成骨、成软骨细胞的分化潜能,且细胞具有增殖能力快、稳定等特点,可以为组织和器官修复提供种质资源。