甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA7的表达与结合活性分析

几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(GenBank登录号为MG604929),该基因长1431bp,包含开放阅读框长1134bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156kD。结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白。分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达。本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据。

棉铃虫双重氧化酶HaDuox的序列特征和表达及病原诱导分析

【目的】探索棉铃虫双重氧化酶在昆虫肠道防御机制中的作用。【方法】克隆棉铃虫HaDuox编码区基因,并利用生物信息学方法分析其编码的氨基酸序列;构建HaDuox膜外1117到1770 bp编码基因的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达特异性蛋白;采用实时荧光定量PCR技术分析棉铃虫幼虫不同组织和不同发育时期HaDuox基因的转录水平;通过测定基因相对表达量研究棉铃虫HaDuox基因对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)诱导的免疫响应。【结果】棉铃虫HaDuox基因开放阅读框长4497 bp,编码1498个氨基酸,预测编码蛋白的相对分子量为171.91 kD。HaDuox与家蚕、橘小实蝇、意大利蜜蜂等昆虫的双重氧化酶结构域类似,含有过氧化物酶结构域,钙离子结合域,铁还原结构域,黄素腺嘌呤二核苷酸结合域和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合域。有7个跨膜区,在第29个和第30个氨基酸位点之间存在一个信号肽切割位点。HaDuox膜外片段在大肠杆菌中成功表达约25 kD的重组蛋白。实时荧光定量PCR结果显示HaDuox基因在马氏管和卵期表达量较高。苏云金杆菌侵染棉铃虫幼虫12 h时诱导HaDuox的大量表达,与对照相比,随着侵染时间的延长,其表达量呈现出先升高后降低再趋于稳定的特点。【结论】实现棉铃虫双重氧化酶基因膜外片段的外源表达,并对HaDuox基因序列特征,不同发育时期和组织表达模式,病原诱导表达进行研究,为研究HaDuox在肠道免疫中扮演的角色及棉铃虫响应病原菌侵染的分子机制提供依据。

适合Pilidium lythri菌丝生长和产孢的培养基

由Pilidium lythri引起的草莓褐色叶斑病是在草莓Fragaria×ananassa上发现的一种新病害。病原菌在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上生长速度慢,产孢量低。为了探讨不同培养基对P.lythri菌丝生长和产孢的影响,筛选适合该病原菌菌丝生长和大量产孢的培养基,本文比较了10种培养基对P.lythri生长和产孢的影响,结果表明,SPDA(添加1.2%草莓果汁的马铃薯葡萄糖琼脂)培养基可以促进P.lythri菌丝生长;CA(胡萝卜琼脂)培养基、V8培养基和TPDA(胰蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂)培养基则可以促进P.lythri大量产生分生孢子。