单核细胞趋化蛋白1对人脐静脉平滑肌细胞增殖的影响

目的研究单核细胞趋化蛋白1对人脐静脉平滑肌细胞增殖的影响。方法用不同浓度单核细胞趋化蛋1(0.1、1.0、10及100μg/L)作用于人脐静脉平滑肌细胞,采用细胞计数、MTT、流式细胞术检测细胞增殖情况;采用逆转录聚合酶链反应检测细胞中cfos基因的表达。结果单核细胞趋化蛋白1能诱导人脐静脉平滑肌细胞的增殖,呈剂量依赖关系,100μg/L单核细胞趋化蛋白1对人脐静脉血管平滑肌细胞的增殖作用强于平滑肌细胞增殖因子血小板源生长因子的作用(P<0.001),单核细胞趋化蛋白1在诱导血管平滑肌细胞增殖的同时引起cfos基因的高表达(P<0.001)。结论单核细胞趋化蛋白1不仅是趋化激活剂,而且是人脐静脉平滑肌细胞的促增殖因子,并且其促增殖的功能可能与增强c-fos基因的表达有关。

金雀异黄素对MCP-1诱导人脐静脉血管平滑肌细胞增殖及c-fos mRNA转录的影响

目的研究金雀异黄素对单核细胞趋化蛋白1(MCP1)诱导的人脐静脉血管平滑肌细胞(hUVSMC)增殖及cfosmRNA转录的影响。方法用不同浓度(10,30,90μmol·L-1)金雀异黄素预作用hUVSMC2h后加入终浓度为10μg·L-1的MCP1作用30min;采用逆转录聚合酶链反应检测细胞中cfos基因的表达;作用48h,用细胞计数检测细胞增殖的情况。结果金雀异黄素在低剂量(10μmol·L-1)即能抑制平滑肌细胞的增殖(P<0.05),在高剂量(30,90μmol·L-1)才能抑制细胞内cfosmRNA的表达(P<0.01,P<0.01)。结论金雀异黄素能抑制MCP1诱导的hUVSMC增殖,其机制可能与降低cfos的表达有关。

流体剪切应力对晚期内皮祖细胞生物学功能的影响

目的研究流体剪切应力处理对晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)体外及体内生物学功能的影响。方法密度梯度离心法分离大鼠骨髓单核细胞,应用EGM-2MV进行体外培养。以3~4代的EPCs,即晚期EPCs为靶细胞,对其施以1.2 Pa剪切应力处理。采用EdU标记技术、黏附能力测定实验、改良的Boyden小室、Annexin V/PI、β-半乳糖苷酶检测法、Matrigel法、荧光定量RT-PCR等方法分别检测剪切应力对晚期EPCs增殖、黏附、迁移、凋亡、衰老、体外成血管及VEGF mRNA表达等生物学功能的影响。应用大鼠颈动脉损伤模型及细胞原位移植等实验手段检测剪切应力预处理对晚期EPCs修复受损内皮的影响。结果 1.2 Pa剪切应力处理可不同程度提高晚期EPCs的增殖、黏附、迁移及成血管能力(P<0.01),上调VEGF的基因表达,抑制晚期EPCs的衰老及凋亡(P<0.01);移植经剪切应力预处理的晚期EPCs可加速损伤内皮的修复,减缓内膜的增生。结论流体剪切应力可改善晚期EPCs的功能活性,提高晚期EPCs修复损伤血管内皮的能力,这为EPCs的临床应用及剪切应力介导的细胞疗法提供了实验依据。

细胞骨架F-actin在层流剪切应力诱导EPCs内皮分化中的作用

目的探讨细胞骨架F-actin在层流剪切应力促内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)向内皮分化中的作用。方法对大鼠骨髓来源的EPCs施以层流剪切应力(1.2 Pa),以荧光定量RT-PCR及流式细胞术检测特异性内皮细胞标记分子vWF、CD31 mRNA及蛋白的表达来反映EPCs分化程度;以免疫荧光染色观测F-actin的排列情况;应用Ras GTPase Pull-Down方法检测Ras活性。结果层流剪切力处理后,EPCs分化标记vWF及CD31的基因及蛋白表达较静止组明显升高(P<0.05),细胞骨架F-actin发生重排,Ras活性明显增高。细胞骨架稳定剂Jasplakinolide(JAS)及细胞骨架松弛剂Cytochalasin D(CytoD)预处理均不同程度地抑制了层流剪切应力所致的细胞骨架的重排、Ras活性的上调及EPCs分化效应(P<0.05),而过表达Ras则对层流剪切应力诱导的EPCs分化有明显促进作用(P<0.05)。结论一定大小的层流剪切应力可促进EPCs向内皮细胞分化,其机制可能与层流剪切应力重塑细胞骨架F-actin,进而影响Ras活性有关;这对于揭示受损血管内皮修复的具体机制、阐明动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机理及临床防治此类疾病具有一定的意义。

TGF-β1调控基质金属蛋白酶-20(MMP-20)启动子转录活性的研究

目的:克隆MMP-20基因启动子序列,分析转化生长因子-β1对其转录活性的影响。方法:检索并分析MMP-20基因翻译起始点上游序列。利用PCR从小鼠基因组上扩增长度为2852bp的启动子序列,并与pMD18-T克隆载体连接。经酶切反应初步鉴定后,以pMD18-T-MMP-20为模板,利用PCR方法获得带酶切位点的MMP-20启动子片段(2842bp),并与pGL3-Basic载体连接。pGL3-MMP-20瞬时转染小鼠成釉细胞系(ALC)过夜后,在培养基中加入1ng/mLTGF-β1,12h后检测荧光素酶的活性。结果:经酶切反应和测序结果证实MMP-20启动子成功插入pGL3-Basic质粒。与pGL3-Basic质粒转染相比较,转染pGL3-MMP-20后荧光素酶活性明显增强;培养基中加入TGF-β1能促使pGL3-MMP-20荧光素酶活性进一步增强。结论:外源性MMP-20启动子在成釉细胞中被激活;TGF-β1能增强pGL3-MMP-20荧光素酶活性,提示釉质发育过程中,TGF-β1具有调节MMP-20基因表达的生物学功能。

流体剪切应力对肝星状细胞的活化和相关基因表达的影响

目的:探讨不同大小的流体剪切应力对大鼠肝星状细胞株HSC-T6的活化和基因表达的影响.方法:对种植于鼠尾胶原上的HSC-T6细胞施以剪切应力处理,剪切应力的大小分别为6、12、20dyn/cm2,干预时间为3h.TRIzol法提取mRNA,采用SYBR Green荧光定量RT-PCR方法分别检测各组-SMA、Collogen-Ⅰ、Collogen-Ⅲ、MMP-2及MMP-9基因的表达情况,流式细胞术检测细胞内蛋白-SMA的表达.结果:剪切应力处理3h后,与对照组相比,6dyn/cm2剪切应力组-SMA、Collogen-Ⅲ的表达降低,但随着剪切应力的增加(12dyn/cm2、20dyn/cm2),-SMAmRNA较对照组表达升高;20dyn/cm2剪切应力组Collogen-Ⅲ基因表达较对照组升高;3种剪切应力组之间Collogen-ⅠmRNA的表达无统计学差异;3种剪切应力均上调MMP-2mRNA的表达.结论:低剪切应力对HSC-T6的活化有一定的抑制作用,相反高剪切应力可以促进HSC-T6的活化,促进Collogen-Ⅲ、MMP-2的表达.

人牙釉质蛋白Amelotin,Ameloblastin及Enamelin基因启动子的初步研究

目的分析人釉成熟蛋白(Amelotin,AMTN)、成釉蛋白(Ameloblastin,AMBN)与釉蛋白(Enamelin,ENAM)基因上游启动子序列,构建不同长度的基因上游启动子报告基因载体,为进一步判断启动子序列的转录调控区奠定基础。方法利用软件分析基因启动子序列,以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中。结果成功地获得了不同长度的Amelotin,Ameloblastin及Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功。结论成功构建了不同长度启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,为进一步研究牙釉质蛋白基因启动子的转录活性及转录调控特点奠定基础。

贵州果柚汁对辛伐他汀调脂作用的影响及机理初探

目的 :研究贵州产果柚汁对辛伐他汀调脂作用的影响及其机理。方法 :将Wistar大鼠随机分为五组。除对照组外 ,其余各组均饲喂高脂饮食 ,各实验组按 5mg/kg辛伐他汀灌胃 ,并加用不同剂量的果柚汁。实验 8周后 ,检测各组大鼠血脂水平 ,采用RT PCR的方法测定肝脏及小肠药物代谢酶CYP3A基因的表达水平。结果 :果柚汁能增强辛伐他汀降低血清胆固醇 (TC)、三酰甘油 (TG)及低密度脂蛋白胆固醇 (LDL C) ,升高高密度脂蛋白胆固醇 (HDL C) ,抑制小肠CYP3A基因表达的作用。结论 :贵州遵义产果柚汁对辛伐他汀的调脂作用具有协同效应 ,其机理可能与果柚汁抑制了CYP3A基因表达有关。

辛伐他汀对大鼠肝脏抗氧化酶活性的影响及果柚汁、橙皮甙的协同作用

目的 观察调脂药辛伐他汀对大鼠肝脏抗氧化酶活性的影响及贵州产果柚汁、橙皮甙对辛伐他汀的协同作用。方法 将Wistar大鼠随机分为 :对照组、高脂血症模型组、辛伐他汀组、低剂量果柚汁 +辛伐他汀组、高剂量果柚汁 +辛伐他汀组、低剂量橙皮甙 +辛伐他汀组、高剂量橙皮甙 +辛伐他汀组。除对照组外 ,其余各组均饲喂高脂饮食 ,各实验组按 5mg/kg辛伐他汀灌胃 ,并分别加用不同剂量的果柚汁或橙皮甙。实验 8wk后 ,检测各组大鼠肝脏抗氧化指标的变化。结果 辛伐他汀显著增强高脂血症大鼠肝脏抗氧化酶SOD、GSH Px、CAT活性及使GSH含量升高 ,降低肝组织MDA含量。贵州产果柚汁、橙皮甙能使辛伐他汀的上述作用进一步增强。结论 辛伐他汀有增强肝脏抗氧化酶活性的作用 ,贵州产果柚汁。

人釉蛋白基因启动子在成釉细胞中的转录活性研究

目的构建人釉蛋白(Enamelin,ENAM)基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,通过分析不同的启动子片段的活性,确定启动子的功能区域,为进一步研究Enamelin基因的转录调控机制奠定基础。方法以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在成釉细胞中活性不同,-1216～-554与-312～-133区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Enamelin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Enamelin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Enamelin基因转录调控特点奠定基础。

完善评估体系 构建医科院校研究生导师管理平台

研究生导师的综合素质和业务水平与研究生的培养质量密切相关，因此，建设一支高水平的研究生导师队伍，是时下我国高等教育改革刻不容缓的任务。而完善评估体系，构建医科院校研究生导师学科管理平台，是加强导师队伍建设与管理，提高导师队伍水平，保障医学研究生的质量，培养高素质的医学人才的必要条件。

釉成熟蛋白真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建釉成熟蛋白真核表达载体pcDNA3.1-Amelotin,并观察其在293T细胞中的表达情况。方法:以出生后6 d的昆明小鼠下颌磨牙中提取的总RNA为模板,设计合成特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠的釉成熟蛋白[Amelotin(GeneID:71421)],包括编码区全长在内的部分cDNA序列,克隆到pMD18-T克隆载体,酶切鉴定正确;然后亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定及测序正确。将构建的重组载体磷酸钙法转染293T细胞,检测Amelotin的表达情况。结果:成功克隆了Amelotin基因编码区全长序列;构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-Amelotin,磷酸钙法转染后可检测到Amelotin基因在293T细胞中的表达。结论:构建了重组pcDNA3.1-Amelotin真核表达载体,并成功表达,为进一步研究该蛋白的生物学活性奠定了基础。

一种大容量细胞灌流液中外泌体的提取方法及鉴定

目的:建立一种从大容量细胞灌流液中提取外泌体的方法,并进行外泌体的鉴定。方法:人脐静脉内皮细胞株(EA.HY926)是人脐静脉内皮细胞和人肺腺癌细胞株A549杂交成的永生化细胞株,因其具有血管内皮细胞的特性,广泛用于内皮细胞相关研究。本研究采用含10%胎牛血清的M199培养基培养,利用Flexcell STR-4000平行板流室系统对EA.HY926施以振荡剪切应力。收集流体剪切应力处理后的细胞灌流液,去除细胞碎片后冻成干粉,脱盐、提取纯化外泌体。电镜观察外泌体形态、纳米粒径电位分析仪检测外泌体大小、PKH26染色检测外泌体膜性结构、BCA蛋白定量法检测外泌体的蛋白浓度、Western blot检测外泌体特异性蛋白CD9和CD81的表达,荧光定量RT-PCR检测内皮细胞相关基因的表达。结果:该方法提取的外泌体,大小均一,结构完整,呈典型囊泡样结构;粒径集中在30~150 nm,多数粒径为97.63 nm;表达外泌体特异性蛋白CD9和CD81;PKH26染色阳性,并可被细胞摄取;EA.HY926分泌的外泌体表达内皮细胞相关的CD31、vWF等mRNA,以及miR-126、miR-21、miR-155等microRNA分子。结论:本方法能够有效从大容量细胞灌流液中提取到结构完整的、高浓度、高质量的外泌体,为开展以流体力学干预细胞为基础的外泌体相关研究提供技术方法。

miR-296-5p靶向PLK1调控PI3K/AKT通路诱导骨肉瘤细胞中的自噬并抑制上皮-间质转化

目的 探讨miR-296-5p靶向PLK1对骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞自噬及抑制上皮-间质转化(EMT)的作用机制.方法 qRT-PCR检测miR-296-5p在OS细胞中的表达.采用生物信息学分析预测miR-296-5p的靶基因,验证miR-296-5p对靶基因PLK1的直接靶向调控;细胞转染构建miR-296-5p过表达和干扰细胞,CCK-8、克隆形成、Transwell小室、流式、蛋白免疫印迹实验检测miR-296-5p的不同表达对U2OS细胞中PTBP1表达水平及细胞增殖、侵袭、凋亡、自噬及EMT的影响.结果 与对照组比较,miR-296-5p在OS中表达降低,而PLK1则升高(P<0.05);与miR-NC组比较,mimic组的克隆形成率、侵袭细胞数目及PTBP1、p62、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平降低,细胞凋亡率、Bec-lin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、E-cadherin水平升高(P<0.05);与PLK1组比较,PLK1+mimic组的克隆形成率、侵袭细胞数目及PTBP1、p62、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平降低,细胞凋亡率、Bec-lin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、E-cadherin水平升高(P<0.05).结论 miR-296-5p可能能够靶向PLK1调控PI3K/AKT通路诱导OS细胞中的自噬并抑制EMT.

三磷酸腺苷敏感性钾离子通道在外源性硫化氢抑制高糖诱导的成骨细胞损伤中的作用

目的研究三磷酸腺苷敏感性钾离子通道(KATP)在硫化氢(H2S)抑制高糖(HG)诱导的成骨细胞损伤中的作用。方法原代培养大鼠下颌骨成骨细胞并鉴定,将成骨细胞给予HG、H2S、KATP通道开放剂吡拉地尔(Pia)、阻断剂格列本脲(Gli)处理后,用Western blot检测KATP通道蛋白的表达水平,同时采用CCK8、实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、茜素红S染色分析方法检测其对成骨细胞增殖、分化及矿化的影响。结果细胞KATP通道蛋白的表达水平在HG的影响下明显降低,H2S预处理明显抑制HG对KATP通道蛋白的下调作用和对成骨细胞增殖的影响,并防止HG引起的成骨细胞分化和矿化的减少;相反,KATP通道阻断剂能明显阻断H2S对成骨细胞的上述保护作用。结论 H2S通过KATP通道抑制了HG诱导的成骨细胞损伤。

剪切应力环境下的内皮祖细胞对肝星状细胞增殖和生物功能的影响

目的:研究流体剪切应力条件下的内皮祖细胞(EPCs)对肝星状细胞(HSCs)增殖、粘附、迁移、凋亡等生物学功能以及成纤维化因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原I(Col-I)、胶原Ⅲ(Col-Ⅲ)表达的影响。方法:将HSCs与EPCs分别接种于共培养小室的上层和下层,共培养24 h后,给EPCs细胞施加12 dyne/cm^2剪切应力,持续24 h。消化细胞,采用CCK-8法检测HSCs的增殖;流式细胞术检测HSCs的凋亡率;细胞贴壁法检测HSCs的粘附功能; Boyden小室检测HSCs的迁移;荧光定量PCR法及Western blot分别检测HSCs的α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA和蛋白质的表达情况。结果:在剪切应力条件下,EPCs生态小境能明显抑制HSCs的增殖、粘附和迁移能力,促进HSCs凋亡,下调HSCs中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA和蛋白质的表达。结论:在剪切应力条件下,EPCs生态小境对HSCs纤维化的发展具有一定抑制作用。

miR-21/PTEN/Akt参与白藜芦醇促EPC的体外成血管能力

目的探讨miR-21及其下游PTEN/Akt信号通路在白藜芦醇促进大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPC)体外成血管能力中的作用。方法采用密度梯度离心法分离大鼠四肢骨髓的单个核细胞,培养于含10%胎牛血清的EGM-2MV完全培养基中诱导分化成EPC,实验用3~5代的EPC。白藜芦醇(20μmol/L)干预12 h后,采用Matrigel胶检测EPC的体外成血管能力;实时荧光定量PCR检测miR-21及PTEN基因的表达情况;干扰miR-21表达后检测EPC的体外成血管能力;双荧光素酶报告基因检测miR-21对PTEN的靶向调控;Western blot检测PTEN蛋白表达情况以及Akt磷酸化水平。结果白藜芦醇(20μmol/L)明显促进EPC的体外成血管能力(P<0.05),抑制了miR-21(P<0.01)的表达,然而却促进了miR-21下游靶基因PTEN的基因(P<0.01)及蛋白表达(P<0.05),进而抑制PTEN下游信号分子Akt的磷酸化水平。双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-21可与PTEN mRNA的3′UTR靶向结合(P<0.01)。结论miR-21调控了白藜芦醇促EPC的体外成血管能力,其机制可能是通过PTEN/Akt信号通路来发挥的,该研究结果揭示了白藜芦醇调控EPC功能一种新的细胞内信号机制。

长链非编码RNAGAS5抑制内皮细胞功能

最新研究表明,长链非编码RNA GAS5(lncRNA GAS5)可调节血管内皮细胞的凋亡,但对内皮细胞其他功能的调控并不明确。本研究旨在了解lncRNA GAS5对内皮细胞的增殖、成血管、NO分泌及内皮标志分子CD31和v WF表达的影响及可能机制。将LncRNA GAS5干扰慢病毒(LVGAS5-RNAi)转染人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)后,采用CCK8及Matrigel胶分别检测EA.hy926的增殖和成血管能力;硝酸还原酶法检测NO的分泌情况;real-time RT-PCR检测CD31、v WF及miR-21的表达;Western印迹检测PTEN在蛋白质水平的表达。结果显示:与对照组比较,LVGAS5-RNAi组EA.hy926增殖能力无明显变化(0.34±0.01 vs.0.34±0.04,P>0.05),而其成血管能力升高(133.70±12.64 vs.100.00±4.65,P<0.05),NO的分泌量亦增加(28.54±2.75μmol/L vs.15.11±1.19μmol/L,P<0.01);内皮标志分子CD31(是对照组的1.46倍)及v WF(是对照组的2.94倍)的基因表达量均显著升高。同时,miR-21表达亦明显升高(是对照组的1.42倍),而miR-21下游靶基因PTEN蛋白质的表达量则显著降低(0.13±0.05 vs.0.38±0.03,P<0.01)。以上结果提示,LncRNA GAS5抑制了内皮细胞的功能,miR-21、PTEN信号分子可能参与其中的调节。