C8orf4基因编码蛋白对猪流行性腹泻病毒体外复制的抑制效应

C8orf4,也称为甲状腺癌1(thyroid carcinoma 1,TC1),最初是从甲状腺癌及其周围正常甲状腺组织克隆而来,在脊椎动物中普遍表达,具有跨物种的序列保守性。研究表明,C8orf4在肿瘤中高表达,参与各种癌细胞间信息通讯,是一种与癌症和炎症有关的新型调节因子,并通过调节NF-κB的转录增强炎症反应,但对病毒的影响知之甚少。为研究C8orf4编码蛋白对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)复制的影响,将PEDV接种于Vero细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测不同时间点PEDV对C8orf4表达的影响;设计并合成表达C8orf4基因的真核表达载体pcDNA3.1-C8orf44-His和特异性siRNA,通过过表达和抑制C8orf4表达,利用qRT-PCR和Western blot检测C8orf4对PEDV复制的影响;进一步,通过过表达C8orf4编码蛋白,明确C8orf4编码蛋白对PEDV复制周期各阶段的增殖变化。随着PEDV感染时间的增长,细胞中C8orf4表达呈上升趋势;过表达C8orf4显著抑制PEDV复制,而干扰C8orf4表达促进PEDV复制,并且C8orf4编码蛋白主要作用于PEDV复制周期的生物合成阶段。本研究表明C8orf4编码蛋白具有抑制PEDV复制的作用,为C8orf4的功能研究提供参考,为抗PEDV复制机制研究提供基础。

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式。采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测。获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3'端编码区2 118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基。核苷酸序列与牛的IGF-IR(XM606794.3)基因同源性为98%,相应的氨基酸序列同源性为99%。SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域。半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达。

吡啶联异噁唑类化合物的设计、合成及抗肿瘤活性

根据已知的激酶变构抑制剂与其靶点激酶的X射线共晶结构,设计了一系列以吡啶联异噁唑为中心结构的潜在激酶变构抑制剂.以2-甲基-5-硝基-3-吡啶甲酸甲酯为原料,通过形成酰胺、磺酰胺和连接嘧啶片段等衍生化手段合成了21个新的吡啶联异噁唑类化合物,其结构经1H NMR,13C NMR和MS确证.采用噻唑蓝(MTT)法测试了所合成化合物的体外抗肿瘤活性,初步测试结果表明该类化合物对肿瘤细胞的增长具有显著的抑制作用.

嘧啶联苯类化合物的设计、合成及抗肿瘤活性

设计合成了一系列以嘧啶联苯为中心结构的潜在激酶变构抑制剂.以2,4-二氯-5-甲基嘧啶为起始原料,通过Suzuki偶联一锅法合成了中心药效团嘧啶联苯,通过X射线单晶衍射分析确认结构,并在此基础上衍生化合成了19个化合物.采用噻唑蓝(MTT)法对所得化合物用人乳腺癌细胞(MCF-7)进行体外抗肿瘤活性初步筛选,并找到2个具有潜在应用价值的化合物8c(IC50=0.224μmol/L)和9c(IC50=0.113μmol/L).

非洲猪瘟病毒核酸双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的构建

研究在利用世界动物卫生组织(OIE)推荐的TaqMan荧光定量PCR方法基础上,增加内标物TaqMan荧光,通过优化反应体系及条件,进行Real-time PCR扩增,建立了一种快速、准确、特异性好的非洲猪瘟病毒核酸双重TaqMan探针荧光定量PCR技术,并进行敏感性、稳定性和特异性评价及比较。结果显示:荧光定量PCR标准曲线线性关系良好,R2值可达到1,敏感性最低能检测到28个拷贝数/μL,比常规PCR方法高40~80倍;通过5份标准质粒重复检测3次,每一个样品重复检测Ct值一致,稳定性良好,变异系数范围0.70%~2.51%;同时每一个样品反应体系中内标物(pUC57-actin)Ct值一致,变异系数范围0.25%~3.44%,因此双重验证了该方法的稳定性;特异性试验证明与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)基因组无交叉反应。该方法具有提升准确率和判断监测体系内是否存在干扰物的优点,可以防止样品出现假阴性;适合于血清样品、组织样品和疫苗样品的非洲猪瘟病毒核酸检测。

猪圆环病毒2型杆状病毒的构建及在Hi5细胞中高效表达

研究克隆PCV2 SY株ORF2基因序列,对N端细胞核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)区域11个氨基酸进行点突变,突变后的ORF2基因先后克隆至pUC57和转移载体pBacF,经PCR及酶切鉴定正确后,转染sf9细胞获得重组杆状病毒,重组杆状病毒在Hi5细胞进行感染及cap蛋白表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果表明,在Hi5细胞28 kDa处有一可被PCV2阳性血清识别的外源cap蛋白高效表达;Hi5细胞中的cap蛋白产量比sf9细胞中产量高,而且比较稳定,均达到350~550μg/mL;同时经蛋白测序得出,上述蛋白序列与NCBI数据库PCV2病毒cap序列配对率达93.59%以上。

黏蛋白2对猪流行性腹泻病毒感染的拮抗作用研究

肠黏膜屏障的完整性与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的致病性密切相关。黏蛋白2(Mucin 2,Muc2)作为肠黏膜屏障的重要组成蛋白,在阻止病原体、毒素和异物入侵等方面发挥重要作用。本文旨在探究黏蛋白Muc2对PEDV复制的拮抗作用。通过观察PEDV感染仔猪空肠黏膜屏障情况,利用RNA干扰策略和分子病毒学检测方法在细胞水平上研究分析Muc2表达水平与PEDV复制的关系,并进一步探讨猪源Muc2天然蛋白发挥抗PEDV作用的具体阶段。结果显示:PEDV感染仔猪空肠段进行PAS染色发现,病毒感染后肠绒毛表面黏液层变薄,结构被破坏,杯状细胞明显减少;与对照组相比,干扰Muc2基因能够上调PEDV⁃N的mRNA及蛋白水平;Muc2蛋白添加后显著抑制PEDV⁃N蛋白的表达,且病毒mRNA水平显著下降(P<0.05);在病毒感染前使用50μg/mL Muc2蛋白预处理1 h后,PEDV⁃N mRNA相对表达量极显著下降(P<0.001),而在病毒吸附、入侵和复制阶段无显著差异(P>0.05),表明Muc2具有降低PEDV侵染宿主细胞的作用。综上所述,本研究验证了Muc2在PEDV感染中的拮抗作用,发现了Muc2主要作用于病毒侵染宿主细胞阶段,为深入探讨Muc2与PEDV间的作用机制奠定了基础,也为制定PEDV新防控策略提供了思路。