稳定表达人巨细胞病毒pUL49蛋白人胚肺成纤维细胞系的建立

目的用逆转录病毒载体介导的基因转移方法,建立稳定表达人巨细胞病毒(HCMV)UL49基因的HELF细胞系。方法首先应用RT-PCR从感染HCMV的HELF细胞RNA中扩增UL49基因,克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1上,以此构建重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-FLAG-UL49,并转染AmphoPack-TM-293细胞,收集逆转录病毒,感染HELF细胞,经G418抗性筛选出阳性细胞。结果经IFA、RT-PCR及Western blot检测到UL49基因在稳定细胞系中表达。结论 HELF-PLEGFP-N1-FLAG-UL49稳定细胞系构建成功。此细胞系为进一步研究HCMV pUL49蛋白的功能提供了一个有力工具。

人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23与宿主蛋白IGFBP4相互作用的鉴定

目的:利用蛋白质相互作用的技术筛选与pUL23相互作用宿主蛋白,为研究pUL23蛋白对人巨细胞病毒繁殖的影响提供线索。方法:通过酵母双杂交系统从人胚肾cDNA文库筛选与pUL23相互作用的宿主蛋白;通过GST-pu ll-down技术研究二者体外物理性相互作用;免疫共沉淀技术进一步研究二者在胞内相互作用。结果:Pu ll-down技术、免疫共沉淀技术确定了宿主蛋白IGFBP4与pUL23具有相互作用。结论:上述结果为研究pUL23蛋白调节病毒自身繁殖功能提供重要依据。

携带乙肝大包膜蛋白L基因与结核Esat6融合基因植物表达载体的构建及鉴定

构建包含编码结核杆菌Esat6基因和乙肝病毒大包膜蛋白(L蛋白)基因的植物双元表达载体,并转化根癌农杆菌LBA4404。分别以质粒pPIC9K-L和结核杆菌基因组为模板进行PCR扩增,获得L和Esat6基因,然后运用部分重叠聚合酶链式反应扩增出L-Esat6融合基因片段,连接到有玉米特异性启动子globulin-1的pEGG载体上,将G-L-Esat6融合基因片段酶切下,连接到含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。构建了真核表达重组质粒pCAMG-L-Esat6,测序分析表明,克隆的L和Esat6序列与NCB I上公布序列一致。成功构建与转化了包含编码乙肝病毒大包膜蛋白L基因和结核杆菌Esat6基因的植物表达载体,并将其转化入根癌农杆菌LBA4404中,为成功研制利用转基因植物生产抗乙肝和结核联合口服疫苗奠定了基础。

表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立

目的建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系。方法通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。结果经600 μg / mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞;ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符。结论成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础。

人干扰素结合蛋白35在人巨细胞病毒感染过程中的表达及意义

目的探讨人干扰素结合蛋白35(interferon-induced protein 35,IFP35)在人巨细胞病毒感染过程中的表达及意义。方法依据是否感染人巨细胞病毒将血细胞分为感染组和未感染组;根据人包皮成纤维细胞转染si RNA和阴性si RNA分为基因敲减组和阴性对照组;采用SYBRGreen荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹法检测不同分组中IFP35的表达量;用人巨细胞病毒感染人包皮成纤维细胞,采用SYBRGreen荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测不同感染复数的人巨细胞病毒感染人包皮成纤维细胞表达IFP35的差异以及相同感染复数的人包皮成纤维细胞感染人巨细胞病毒0、12、24、48、96小时后IFP35表达的差异;敲减IFP35基因后,检测人巨细胞病毒量的变化情况。结果感染组血细胞中IFP35表达量显著高于未感染组(P<0.05)。感染后细胞中IFP35的表达量随人巨细胞病毒浓度的增加而增加,与经感染复数为0的人巨细胞病毒感染后的细胞比较,经感染复数为0.01、0.1及1.0的人巨细胞病毒感染后细胞中IFP35的表达量均显著升高(P<0.05)。IFP35的表达量随人巨细胞病毒感染时间的延长而增加,且与0小时相比,其余时间其表达量均显著增加(P<0.05)。基因敲减组人包皮成纤维细胞中IFP35的表达水平显著低于阴性对照组(P<0.05)。敲减IFP35基因的人巨细胞病毒DNA基因拷贝数较未敲减IFP35基因的人巨细胞病毒显著增加(P<0.05)。结论 IFP35的表达量与人巨细胞病毒感染的浓度和时间均呈正相关。IFP35基因的表达可能在一定程度上抑制人巨细胞病毒的感染。

稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23细胞系建立及其功能研究

目的:建立稳定表达人巨细胞病毒UL23基因的HELF细胞系,研究病毒蛋白在宿主细胞内行为,为进一步研究人巨细胞病毒蛋白pUL23的功能提供依据。方法:通过PCR技术从人巨细胞病毒基因组中扩增出UL23基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1-FLAG-UL23。将该载体导入Am-phoPackTM-293细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染HELF细胞,HELF经持续G418抗性筛选后获得稳定表达UL23基因的细胞系。采用激光共聚焦显微镜观察病毒蛋白在细胞内的定位。结果:RT-PCR、Western blotting结果证实病毒基因UL23能够整合到宿主细胞基因组中,并能在宿主细胞中稳定表达病毒蛋白。共聚焦显微镜观察到病毒蛋白pUL23定位于细胞质,处于细胞核周边。结论:利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,成功构建了稳定表达UL23基因的转基因细胞系。该病毒蛋白在宿主细胞质中的定位,提示病毒蛋白发挥功能的空间位于细胞核周边,有利地推进了人巨细胞病毒蛋白pUL23功能研究的进程。

伊蚊C型凝集素mosGCTL-2是登革病毒感染相关的重要蛋白质（英文）

C型凝集素是一类含有糖结合结构域的蛋白质,从节肢动物到哺乳动物的C型凝集素都具有共同的基序,它在进化上相当保守,在免疫反应中发挥重要作用.埃及伊蚊表达30多种C型凝集素蛋白,它是登革病毒的关键传播媒介,这些蛋白质对病毒和细菌感染均有至关重要的作用.最近研究表明,C型凝集素mosGCTL-3与二型登革热病毒包膜蛋白具有相互作用,能够增强登革病毒对埃及伊蚊的感染.在本文中,我们发现了C型凝集素蛋白mosGCTL-2具有与mosGCTL-3类似的功能.两种C型凝集素mosGCTL-2和mosGCTL-3的氨基酸残基序列一致性高达43.56%.为研究mosGCTL-2在登革病毒蚊媒传播中的作用,我们通过果蝇S2细胞表达系统表达纯化了mosGCTL-2蛋白.结果表明,mosGCTL-2与二型登革热病毒包膜蛋白的结合具有钙离子依赖性.进一步的研究表明,埃及伊蚊感染登革病毒能够诱导mosGCTL2表达上调,是二型登革热病毒感染埃及伊蚊所必需的蛋白质.以上研究说明,mosGCTL-2蛋白可能是在登革热病毒感染埃及伊蚊中起重要作用的一种模式识别受体.

HSA模型在初中地理教学中的应用--以“滔滔黄河”为例

传统分科教学,虽能使学生在本学科垂直领域内进行结构化、系统化的学习,快速梳理框架、记忆知识点,但因交叉学科知识的缺失,学生学习的能动性与综合思维很大程度上被限制。在提倡培养全面型人才的背景下,HSA课堂模型打破学科边界,将文、理、艺跨学科深度融合,摆脱分科教学单一纵向的教学困境,充分调动学生学习的主观能动性,是在融合教育基本理念的基础上对学科整合的进一步具化。地理学科是HSA跨学科整合教学的有效载体,本文以《地理八年级上册》(湘教版)“滔滔黄河”为例,确定合理的多学科整合教学目标,设计以学生为主、讲解为辅的教学活动,能充分发挥地理学科跨界性与综合性的特点,教会学生学习对生活有用、贴合实际的地理。

LTQ-FT-MS技术结合生物信息学筛选与HBV Polymerase存在潜在相互作用的宿主蛋白

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是慢性肝病的一个主要致病因素,易导致肝炎、肝硬化,并最终导致肝癌。乙型肝炎病毒聚合酶(HBV Polymerase,Pol)在HBV复制过程中起着关键作用,并有可能参与肝癌的发生。Pol的这些生理功能很有可能是通过与蛋白质之间的相互作用来行使的。本文通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术,筛选、鉴定与Pol存在潜在相互作用的蛋白。用构建好的pcDNA3.1-POL-flag重组质粒转染HeLa细胞,LC-MS/MS技术筛选能与融合flag标签的Pol发生免疫共沉淀的蛋白,共得到45个蛋白,其中11个蛋白被报道能与Pol发生相互作用。Ingenuity Pathway Analysis(IPAR○)软件进一步分析45个蛋白与Pol的功能及相应的细胞网络,发现这些蛋白涉及三个大分子网络,其中4个蛋白可能参与协助Pol在细胞网络中行使其生理功能,对这4个蛋白的进一步研究将有助于为攻克乙型肝炎病提供线索。