大鼠ACAT的N末端片段(氨基酸1～126)在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的： 重组法制备纯化乙酰辅酶Ａ：胆固醇酰基转移酶（ＡＣＡＴ）Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）。 方法：经ＰＣＲ扩增得到的ＡＣＡＴ的Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）用ＥｃｏＲＩ酶解，插入到表达载体ｐＧＥＸ－２ＴＫ中，得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－２ＴＫ／ＡＣＡＴ（氨基酸１～１２６）。阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－Ａ－ＣＡＴ（氨基酸１～１２６），重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ亲和柱纯化。 结果：ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析显示得到了纯的ＧＳＴ－ＡＣＡＴ（氨基酸１～１２６）融合蛋白。 结论：ＡＣＡＴ的Ｎ末端膜外结构域（氨基酸１～１２６）的分离纯化为抗ＧＳＴ－ＡＣＡＴ（Ｎ 末端片段）抗体的制备及其ＡＣＡＴ结构和功能关系的进一步研究打下了基础。

大鼠乙酰辅酶A∶胆固醇酰基转移酶的C末端片段在大肠杆菌中的融合表达及纯化

为进一步探讨乙酰辅酶Ａ：胆固醇酰基转移酶的结构和功能的关系，经聚合酶链反应扩增得到的乙酰辅酶Ａ∶胆固醇酰基转移酶（ＡＣＡＴ）的Ｃ末端膜外结构域（氨基酸４８０～５４５）用Ｅｃｏｒｌ酶解，插入到表达载体ｐＧＥＸ２ＴＫ中，得到重组表达质粒ｐＧＥＸ２ＴＫ／ＡＣＡＴ（氨基酸４８０～５４５）。阳性重组子在大肠杆菌中经异丙基βＤ硫代半乳糖苷诱导表达谷胱甘肽转移酶－乙酰辅酶Ａ∶胆固醇酰基转移酶（氨基酸４８０～５４５），重组表达菌裂解上清液经谷胱甘肽ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ亲和柱纯化。十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析显示得到了较纯的谷胱甘肽转移酶－乙酰辅酶Ａ∶胆固醇酰基转移酶（氨基酸４８０～５４５）融合蛋白。乙酰辅酶Ａ∶胆固醇酰基转移酶的Ｃ末端膜外结构域（氨基酸４８０～５４５）的分离纯化为抗谷胱甘肽转移酶－乙酰辅酶Ａ∶胆固醇酰基转移酶（Ｃ未端片段）抗体的制备及其乙酰辅酶Ａ∶胆固醇酰基转移酶结构和功能关系的进一步研究打下了基础。