齐墩果酸抗环磷酰胺所致大鼠肝细胞损伤作用

目的研究齐墩果酸(OA)对环磷酰胺所致大鼠肝细胞损伤的保护作用。方法分离大鼠肝细胞,进行原代培养。检测实验大鼠肝细胞上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肝细胞MTT值。结果环磷酰胺可使肝细胞上清液ALT、AST及LDH活力升高,肝细胞MTT值减小,齐墩果酸能抑制上述变化。结论齐墩果酸可抗环磷酰胺所致肝细胞损伤。

体内外急性酒精性肝损伤模型的研究

目的:建立体内外急性酒精性肝损伤模型,为进一步研究药物对肝损伤的保护作用奠定基础。方法:测定乙醇的半数致死量,观察不同给药途径不同剂量下血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性变化。利用乙醇体外诱导原代培养的肝细胞损伤,检测不同时间和剂量下培养液上清乳酸脱氢酶(LDH)释放量。结果:小鼠灌胃乙醇的半数致死量为9．98 g·kg-1,乙醇灌胃剂量大于6．4 g·kg-1、腹腔注射剂量大于4．0 g·kg-1时,血清ALT、AST有升高趋势。50-400 mmol·L-1乙醇作用于大鼠肝细胞,培养液上清中LDH释放量有增加趋势。结论:体内、体外急性酒精性肝损伤的最适损伤剂量分别为7．2 g·kg-1和50～100 mmol·L-1。

比较两种消化酶对分离大鼠肝细胞的影响

目的:比较胶原酶和胰蛋白酶在分离大鼠肝细胞数量、活力、原代培养及MTT试验等四个方面的差别。方法:分别用胶原酶和胰酶分离获取大鼠肝细胞,通过台盼蓝拒染试验测细胞活力并计数,将分离的肝细胞进行原代培养并观察肝细胞形态变化,采用噻唑蓝(MTT)试验测肝细胞的增殖状况。结果:胶原酶分离的肝细胞数量是胰酶的2．4倍,而胰酶分离的肝细胞活力是胶原酶的2．8倍;胶原酶分离的肝细胞原代培养时贴壁慢,生长不良,而胰酶分离的肝细胞贴壁快,生长良好;MTT试验结果表明胰酶分离培养的细胞活性明显高于胶原酶。结论:胶原酶分离的细胞数量及纯度优于胰酶,而胰酶分离的细胞活力优于胶原酶。

重组人角质细胞生长因子对放射性和放疗性口腔黏膜炎的防治作用

目的评价重组人角质细胞生长因子(rhKGF)对口腔黏膜炎(OM)的预防和治疗作用。方法以MTT法检测rhKGF对32D-KGFR细胞体外增殖的促进作用。大鼠头部经15.3 Gy 60Co辐射制备放射性OM模型,预防组在照射前3 d iv给予rhKGF 0.75,1.5和3 mg.kg-1或帕利非明1.5 mg.kg-1,每天1次,共3次;预防+治疗组在照射前3 d及照射后第2天和第4天iv给予rhKGF 1.5 mg.kg-1,共5次。小鼠iv给予5-氟尿嘧啶50 mg.kg-1,每天1次,连续4 d,制备化疗性OM模型,预防组在化疗开始前3 d iv给予rhKGF1.25,2.5,5 mg.kg-1或帕利非明2.5 mg.kg-1,每天1次,共3次;预防+治疗组在化疗开始前3 d及末次化疗后第2天和第4天iv给予rhKGF 2.5 mg.kg-1,共5次。通过观察临床症状、进食量、体质量变化、死亡率和OM发生率以及组织形态变化评价对OM的预防和治疗作用。结果 rhKGF 6.25～100μg.L-1可促进32D-KGFR细胞增殖反应。在放射性OM模型中,正常对照组、模型组、rhKGF 0.75,1.5和3 mg.kg-1预防组、预防+治疗组及帕利非明预防组大鼠OM发生率分别为0/12,12/12,8/12,6/12,5/12,5/12和5/12,rhKGF 1.5和3.0 mg.kg-1预防组、预防+治疗组和帕利非明预防组在放疗后第6天大鼠进食量显著高于模型组(P<0.05),第6和12天时各给药组体质量均显著高于模型组(P<0.05);另外,各给药组OM症状积分均降低,出现时间延迟,病程缩短。在化疗模型中,正常对照组、模型组、rhKGF预防1.25,2.5,5 mg.kg-1组、预防+治疗组及帕利非明预防组小鼠OM发生率分别为0/16,16/16,10/16,8/16,5/16,10/16和6/16,各给药组在末次化疗后第3和6天能显著缓解化疗引起的进食量减少;与模型组比较,rhKGF和帕利非明预防组小鼠肠黏膜厚度增加,绒毛膜上皮细胞增加,杯状细胞饱满粗大,小肠隐窝深度可见,绒毛形态正常,尤以rhKGF 2.5 mg.kg-1预防组作用最明显;rhKGF预防+治疗组的作用不及同剂量rhKGF预防组。结论rhKGF可预防放射性或化疗所致OM。

肿瘤免疫研究中常用的小鼠模型

肿瘤免疫(IO)治疗已成为肿瘤治疗研究领域的热点,并在多个适应证中取得了革命性的突破。针对IO产品开发的基础研究和临床试验取得了较大的进展,但也面临许多转化医学方面的挑战,其中动物实验对人体免疫相关不良反应的预测性较差是最为突出的问题。特定免疫表型的小鼠模型能在一定程度上模拟肿瘤患者的系统免疫状态和肿瘤微环境,因而广泛应用于IO候选分子的非临床有效性和安全性研究。本文简略回顾了目前IO研究中常用的小鼠模型,着重对免疫检查点药物研究中常用的小鼠模型进行分析,并提出相关非临床研究的建议,供读者交流和讨论。

IPRP关于基因治疗产品生物分布研究的相关考虑

目前各监管机构对基因治疗产品的生物分布研究可能有不同的要求,为基因治疗产品的开发带来了挑战。国际药物监管计划(IPRP)的基因治疗工作组(GTWG)于2018年6月编写了Expectations for Biodistribution Assessments for Gene Therapy Products意见书,该文件代表了当前不同地区的药品监管机构对支持基因治疗产品进入临床试验和上市申请时需要开展的非临床生物分布研究的认识,重点讨论了支持首次临床试验的生物分布研究、试验设计需考虑因素以及允许在首次临床试验后开展生物分布研究的情况。本文拟通过对该意见书的介绍,概述基因治疗药物生物分布研究的一般考虑,希望对我国基因治疗产品的生物分布研究相关的研发和审评工作提供参考。

抗促胃液素疫苗mG17-CRM197单用及联合5-FU抑制小鼠结肠癌的生长

目的:观察抗促胃液素(gastrin,又称胃泌素)疫苗mG17-CRM197(mG17)单用及联合氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)对小鼠结肠癌C38移植瘤的抑制作用。方法:采用Western blotting法检测结肠癌细胞促胃液素受体(CCKBR)的表达情况,磺酰罗丹明B(SRB)法检测mG17-NH2对C38细胞增殖的影响。C57BL/6小鼠随机分为PBS组、CRM197组、mG17组、5-FU组和mG17/5-FU组,ELISA法检测小鼠血清中抗G17抗体水平;免疫后的小鼠皮下进行肿瘤移植,5-FU组和mG17/5-FU组给予5-FU(20 mg/kg,q2d×5),其他组给予生理盐水,通过肿瘤生长曲线和瘤质量评价不同治疗方案对C38移植瘤生长的影响。结果:小鼠结肠癌C38细胞表达CCKBR,mG17-NH2浓度依赖性上调CCKBR的表达,且能促进C38细胞增殖(细胞增殖率为115.7%～133.5%)。mG17疫苗免疫3次后,小鼠血清抗mG17抗体水平依次升高。mG17组、5-FU组和mG17/5-FU组对C38移植瘤有显著抑制作用,抑瘤率分别为58.0%、60.5%和80.7%;按金氏法计算,mG17与5-FU联用的Q值为0.97,两药联用出现相加作用。结论:mG17-CRM197疫苗对小鼠结肠癌C38移植瘤治疗有效,与5-FU联用增强对小鼠结肠癌的抑制。

聚山梨酯-80致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的研究

目的:研究聚山梨酯-80对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒释放组胺的影响。方法:培养大鼠来源的RBL-2H3肥大细胞,取不同厂家来源的聚山梨酯-80与RBL-2H3细胞共培养60min,用荧光分光光度法定量检测RBL-2H3细胞释放的组胺量,计算组胺释放率。结果:不同厂家来源的聚山梨酯-80与RBL-2H3细胞作用60min后,细胞的组胺释放率与空白对照组相比均显著增加,在一定浓度范围内,组胺的释放随聚山梨酯-80浓度的增加而增加。结论:聚山梨酯-80可导致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,并存在着明显的量效关系,为研究聚山梨酯-80致过敏反应机制提供了一定的依据。

毕赤酵母表达去氨普酶及其突变体的溶栓活性研究

目的:研究毕赤酵母表达野生型去氨普酶(DSPAwt)及其突变体F195和QNRR的溶栓活性,为开发新型溶栓类药物奠定基础。方法:以阿替普酶(rt-PA)和中国仓鼠卵巢细胞表达野生型DSPAα1为阳性对照,采用大鼠动-静脉旁路血栓模型,通过对血栓重量、出血时间、大鼠凝血指标凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)和纤维蛋白降解产物D-二聚体的测定考察毕赤酵母表达DSPAwt及其两种突变体的溶栓活性。结果:DSPAwt及其突变体F195和QNRR在0.7mg/kg和1.5mg/kg剂量下均有一定的溶栓活性,其中DSPAwt溶栓作用较弱,有效动物数少,溶栓率较低,相同剂量突变体F195和QNRR溶栓作用显著增强,溶栓效果与DSPAα1接近。此外,不同剂量各样品均能在一定程度上延长大鼠出血时间,延长大鼠血浆TT、PT和APTT,提高血浆中D-二聚体含量。结论:通过酵母表达系统有望获得具有高溶栓活性的突变型DSPA,从而开发成新一代溶栓类药物。

可溶性靶点分子对生物制品抗药抗体桥连法检测的挑战和应对策略

生物制品进入机体后可能诱导免疫应答,产生抗药抗体(ADA)。开发灵敏度高、特异性强的ADA检测方法是免疫原性评价的基础,其中桥连法应用最广。桥连法检测易受多种因素影响,其中可溶性靶点分子对ADA检测的影响会因其存在形式、基线水平、给药导致的浓度改变或代偿性变化等而产生差异,引起假阳性或假阴性结果,进而影响药物免疫原性风险的评估。本文重点讨论ADA检测中可溶性靶点分子的潜在干扰及其应对策略,以期为ADA检测方法开发提供一定参考。

EMA关于固定复方药物临床开发指导原则介绍

欧洲药品管理局(EMA)于2017年3月发布了关于固定复方药物临床开发的指导原则,该指导原则讨论了固定复方药物临床开发过程中的考虑要点和基本技术要求。我国目前尚无类似文件,通过对该指导原则的介绍,希望对我国固定复方药物的研发和审评工作提供参考。

N-乙酰半乳糖胺偶联小干扰RNA类药物的非临床毒性研究进展

小干扰核糖核酸(siRNA)作为核苷酸类药物,通过RNA干扰(RNAi)特异性诱导基因沉默而发挥作用,在代谢性疾病、抗感染及肿瘤等领域被广泛应用。目前已获批上市4款基于N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶联技术siRNA药物,汇总分析已上市GalNAc偶联药物的非临床毒性特征及临床不良反应,初步明确非临床研究中毒性常见类型,包括脱靶与非脱靶毒性等。结合GalNAc-siRNA类药物非临床研究实践,了解可预测的脱靶毒性及对于非临床安全性评价中的毒性关注点,以期为GalNAc-siRNA药物临床研究提供参考。

抗体类药物超敏反应研究进展

抗体类药物在临床应用中很可能导致不同类型的超敏反应(hypersensitivity reaction,HSR)。在近期某些创新单抗或双功能抗体的非临床研究中,相关动物种属或人源化动物模型给予候选分子也常见非预期HSR,严重时可能对药效学、药动学和/或毒理学研究结果的解读和评价以及人体不良反应的预测造成干扰。探索HSR发生的机制有助于科学分析非临床研究的结果,并对临床试验中人体用药风险的评估和相应的风险缓解策略的制定提供更有价值的参考信息。本文对抗体类药物导致的HSR类型、临床表现和诊断方法、可能的发生机制进行了综述,并对非临床研究中HSR相关标志物的检测方法和必要性进行了探讨,以供研究者和监管机构关注或参考。

肿瘤免疫治疗药物相关种属选择的一般考虑

肿瘤免疫基础研究和临床研究的快速发展使越来越多的新疗法成为可能,新的免疫检查点抑制剂、共刺激分子激动剂(本文中统称为肿瘤免疫治疗药物)以及以此为基础的联合用药展现了未来的研究方向。由于这类药物的生物活性大多具有较高的种属特异性,健康动物中目标靶点的表达特性与人体疾病状态(或疾病部位)下的表达特性存在较大差异。因此,非临床安全性评价中的一个主要挑战是确定能够预测临床风险尤其是免疫相关不良事件(irAEs)的相关种属或/动物模型。本文分析了肿瘤免疫治疗药物非临床安全性评价中存在的挑战,并结合ICH S6(R1)指南和帕博利珠单抗非临床研究案例简述了相关种属选择时的一般考虑,供申请人和监管机构关注或参考。

抗体药物偶联物抗药抗体中和活性分析研究进展

抗体药物偶联物(ADCs)是由单克隆抗体、连接子和小分子细胞毒素构成的多结构域分子。ADCs通过单克隆抗体特异性地结合肿瘤细胞表面高表达的靶抗原,经抗原介导的内化作用进入细胞并释放细胞毒素,可提高疗效并降低细胞毒素对正常组织、细胞的毒性。与常规单克隆抗体一样,ADCs作为蛋白药物,具有免疫原性。此外,由于偶联引入了新的抗原表位,ADCs药物有可能诱导机体产生更为复杂的免疫反应,从而可能影响药物的有效性和安全性。对ADCs诱导的抗药抗体(ADA)进一步表征,尤其是中和活性试验,有助于分析和预测因ADA的产生而可能导致的对有效性和安全性的影响。由于ADCs药物结构和作用机理的特殊性,针对不同结构域而产生的ADA均可能具有中和活性,通过多种机制阻断ADCs药物内化,或阻碍细胞毒素分子释放,从而降低细胞杀伤效应或导致脱靶毒性。因此,ADCs药物的中和抗体检测方法的设计和开发不同于常规抗体类药物,且具有较大的挑战。本文简述了ADCs药物免疫原性分析中中和活性检测方法及目前存在的挑战,以期对该领域的相关研究提供借鉴和参考。

结合案例介绍ICH溶瘤病毒非临床研究一般考虑

作为一种新兴的肿瘤免疫治疗方法,溶瘤病毒在肿瘤免疫治疗领域表现出较好的应用前景。溶瘤病毒除了能产生选择性溶瘤作用外,还可诱导产生局部和/或系统性的抗肿瘤免疫应答。ICH于2009年9月发布了关于《溶瘤病毒》的指导文件,就溶瘤病毒开发相关的表征、非临床和临床研究等方面的内容给出了建议。我国尚无关于溶瘤病毒产品开发相关的指南,本文结合FDA和EMA批准的溶瘤病毒药物talimogene laherparepvec(T-VEC)已公开的非临床研究资料,对该文件中涉及的非临床研究相关的内容进行了简要介绍,以期对我国溶瘤病毒产品的研发和审评工作提供参考。

CPT-11脂质体对人结肠癌HT-29移植瘤的抗肿瘤活性及药代-药效相关性分析

目的:考察CPT-11脂质体(lipoCPT-11)对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的抑制作用,并对产生这一作用的物质基础,即药代-药效相关性进行分析。方法:建立HT-29裸鼠移植瘤模型,在药效研究中lipoCPT-11分别以5,25,50 mg·kg-1给药,已上市普通制剂(cCPT-11)剂量为50 mg·kg-1,iv给药,1周2次,连续3周;在药代试验中,lipoCPT-11和CPT-11分别以5,50和50 mg·kg-1经iv给药1次,分别于给药前和给药后不同时间采集肿瘤组织和血浆,采用经验证的LC-MS/MS法检测CPT-11和SN-38的浓度。结果:lipoCPT-11对HT-29移植瘤的抑制作用具有显著的剂量依赖性,5 mg·kg-1组药效与cCPT-11 50 mg·kg-1相当,50 mg·kg-1组肿瘤抑制率显著高于cCPT-11;lipoCPT-11组肿瘤和血浆中CPT-11和SN-38的滞留时间长于cCPT-11,50和5 mg·kg-1组原形药AUC0-t分别是cCPT-11(50 mg·kg-1)的426.1和31.1倍(血浆)及9.5和0.4倍(肿瘤),SN-38的比例分别为5.0和1.0倍(血浆)及5.4倍和1.0倍(肿瘤)。结论:lipoCPT-11对HT-29移植瘤的抑制作用显著高于cCPT-11,这与脂质体制剂延长了活性成分在体内的滞留时间以及提高了肿瘤和血浆中的有效暴露相吻合,具有重要的临床应用价值和开发前景。

盐酸伊立替康脂质体临床前药代动力学、耐受性和药效学研究

目的:研究盐酸伊立替康脂质体与盐酸伊立替康注射液相比,在药代动力学、毒理学和药效方面的改善程度。方法:考察盐酸伊立替康注射液和盐酸伊立替康脂质体分别以1 mg·kg-1经静脉给药在Beagle犬体内的药代动力学;经静脉注射给药对昆明小鼠的最大耐受量(MTD);对裸鼠皮下接种人结肠癌HT-29、人胃癌NCI-N87移植瘤的抑制作用,通过各组药代动力学参数、MTD和相对肿瘤体积的动态变化比较其改善程度。结果:盐酸伊立替康注射液和脂质体在犬体内的t1/2分别为1.50和9.83 h;脂质体的AUC0～t为注射液的95倍;MTD分别为80和160 mg·kg-1;对HT-29和NCI-N87移植瘤模型的最高抑制率分别为54.2%,97.3%和55.4%,98.5%,且给予5 mg·kg-1脂质体的疗效与50 mg·kg-1注射液相当。结论:盐酸伊立替康脂质体在药代动力学、毒理学和对HT-29,NCI-N87的疗效方面明显优于注射液。

偏头痛新药靶向降钙素基因相关肽(CGRP)单抗药物的非临床评价要点

偏头痛是一种常见的神经系统疾病,以单侧搏动性头痛为主要特征。降钙素基因相关肽(CGRP)在偏头痛的发病机制中发挥重要作用,并由此开发了用于偏头痛的CGRP拮抗药物,近期有3个以CGRP单抗或CGRP受体的单抗药物Aimovig■、Ajovy■和Emgality■被FDA批准上市。概述了这3个单抗新药的非临床研究内容,并结合ICHS6 (R1)分析了生物制品类新药非临床研究的要点,以期为国内该类药物的研发提供参考。

FDA关于《脂质体药物CMC、人体药动学和生物等效性研究以及标签管理》的行业指南介绍

美国食品药品监督管理局(FDA)于2018年4月发布了《脂质体药物CMC、人体药动学和生物等效性研究以及标签管理》的行业指南,该指南讨论了在脂质体药物新药上市申请(NDA)和简略新药申请(ANDA)过程中,申请人需要向CDER提交的研究资料内容,主要包括:化学成分生产和控制(CMC);人体药动学和生物利用度研究(对于ANDA则为生物等效性研究);以及NDA或ANDA产品的标签内容。我国目前尚无类似的指南,通过该指南的介绍,希望对我国脂质体药物的研发和审评工作提供参考。