基于网络药理学和分子对接探究白杨素和柚皮素抗PEDV的作用机制及试验验证

【目的】探讨白杨素和柚皮素抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的作用靶点和机制,为进一步以白杨素和柚皮素开发新型抗PEDV的治疗药物提供理论依据。【方法】利用PharmMapper、TCMSP、SEA Search Server和STITCH在线数据库获得白杨素和柚皮素的潜在作用靶点,同时检索GeneCards数据库获得PEDV对宿主的作用靶点,利用在线程序Draw Venny Diagram获取白杨素、柚皮素与疾病的交集靶点。通过STRING数据库和Cytoscape 3.9.1软件构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选关键靶点,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。通过AutoDock Vina v 1.2.0软件对核心靶点及小分子进行分子对接,并分析白杨素和柚皮素与靶蛋白的结合能和结合模式,利用PyMOL v 2.5实现对接结果的可视化。采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测白杨素和柚皮素对核心靶蛋白表达的影响。【结果】白杨素潜在抗PEDV的靶点有12个,其中白蛋白(ALB)、雌激素受体1(ESR1)、转化生长因子β-1蛋白(TGF-β1)可能是白杨素抗PEDV的核心靶点;柚皮素潜在抗PEDV的靶点有18个,其中ALB、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)可能是柚皮素抗PEDV的核心靶点。白杨素抗PEDV靶点涉及21种生物过程、5种细胞组分和6种分子功能,共获得11条信号通路;柚皮素抗PEDV靶点涉及31种生物过程、8种细胞组分和19种分子功能,共获得13条信号通路。核心靶点与两种天然化合物之间以氢键和疏水作用力为主,有较强的相互作用。白杨素和柚皮素能极显著降低Caspase-3表达量(P<0.01),可能通过影响Caspase-3的表达和活化来颉颃PEDV诱导的细胞凋亡;极显著升高TGF-β1蛋白表达量(P<0.01),可能通过影响TGF-β1的表达抗PEDV诱导的炎症反应而治疗PEDV的感染。【结论】本研究揭示了白杨素和柚皮素分别通过潜在核心靶点ALB、ESR1、TGF-β1和ALB、Caspase-3、PPARG,以及IL17、PI3K-Akt和AMPK信号通路发挥抗PEDV作用的机制,为新型抗PEDV药物的研发提供新的思路。

抗猪流行性腹泻病毒天然化合物研究进展

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起猪腹泻病的重要传染性病原之一,在国内外广泛流行,严重制约着生猪养殖业的发展。PEDV不断增强的遗传变异性对现有商品化疫苗的免疫保护效果造成影响,使单纯以疫苗免疫实现对PEDV的传播阻断和净化相对困难。对PEDV感染猪的治疗也是挽回经济损失的重要途径,但目前国内外尚无针对PEDV的有效治疗药物,现有广谱抗病毒化学药物多被禁止在农产品生产过程中使用。天然化合物因具有来源丰富、生物活性多样和毒副作用小等特征已成为新型抗病毒先导药物研发的热点。目前国内外学者对萜类、黄酮类、酚酸类、鞣酸类、多糖类和生物碱类等多种天然化合物的抗PEDV作用及机制的研究取得诸多新进展,文章对上述研究进展进行了整理和综述,旨在为抗PEDV药物的研发提供理论参考。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌共感染的综合鉴定

为了对四川省某肥育猪场疫病原因进行确诊并为其提供临床用药指导,研究从发病猪场采集病变组织样本进行细菌分离纯化;通过PCR分别检测并鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和副猪嗜血杆菌(HPS)基因型和血清型,并进行核苷酸变异性分析和遗传进化分析;用K-B纸片法筛选HPS敏感抗生素。根据病猪高热、耳根四肢发绀;全身淋巴结肿大,肺脏、肝脏肿大实变等主要临床症状和病理变化,结合PCR初步确定引发该次疫情的主要病毒为PRRSV。进一步对该毒株Nsp2基因进行克隆测序和比对分析发现其与广西分离株PRRSV HUN4-like GXBH1404株序列相似度高达99.17%。根据本次分离的毒株和参考的毒株建立了基于Nsp2基因的进化树,该毒株属于Lineage8谱系的HP-PRRSV毒株,与谱系8中的代表毒株JXA1和HUN4、GXBH1404及四川流行毒株SCCD16、SC2012等5个毒株相比,SCLZ202201株Nsp2基因共存在9个独有的碱基突变,与四川流行毒株相比共存在21个碱基突变,表明HP-PRRSV仍在四川地区持续流行,其基因多样性也在不断增加。经细菌分离纯化获得一株依赖NAD生长的革兰氏阴性短杆菌,结合PCR和生化鉴定,综合判定该菌为血清5型副猪嗜血杆菌(HPS)菌株。药敏试验结果显示,该细菌对新霉素、恩诺沙星、庆大霉素、头孢克洛、头孢氨苄较敏感;对林可霉素、卡那霉素、多西环素中介;对头孢拉定耐药。由此确定,该次猪场疫情由PRRSV HUN4-like毒株和HPS 5型菌株混合感染所致。研究确定了引发该次疫情的主要原因,为养殖场相关疫病的防控提供了理论依据。