基于难治性癫痫患者脑网络特征的立体脑电图引导射频热凝毁损术预后预测

射频热凝毁损术(RFTC)治疗难治性癫痫的疗效的个体差异较大。本课题旨在研究术前脑网络图论指标,建立预测RFTC预后的模型。基于45例难治性癫痫患者术前的立体脑电图数据,建立时变多变量自回归模型,通过计算频谱加权的时变部分指向性相干,构建时变效应连接网络,计算图论指标。根据RFTC后至少3个月的Engel分级,将患者分为RFTC有效组(EngelⅠ和Ⅱ级)与RFTC无效组(EngelⅢ级),进行组间图论指标的统计学分析,并基于图论指标,应用支持向量机(SVM)建模进行预后预测。结果表明,RFTC有效组的标准化的平均聚类系数(P=0.000)、小世界性(P=0.022)显著高于RFTC无效组,标准化的特征路径长度显著低于RFTC无效组(P=0.032)(RFTC有效组的标准化的平均聚类系数、小世界性和标准化的特征路径长度分别为0.9953±0.0002、0.8530±0.0062和1.1688±0.0085;RFTC无效组的标准化的平均聚类系数、小世界性和标准化的特征路径长度分别为0.9940±0.0002、0.8335±0.0056和1.1944±0.0080);应用以上3个指标,通过SVM进行RFTC疗效的预测,准确率达到81.97%。应用难治性癫痫患者术前的脑效应连接网络图论指标标准化的平均聚类系数、标准化的特征路径长度和小世界性建立的预后预测模型可以很好地预测RFTC疗效。

A型魏氏梭菌α毒素Asp-56基因定点突变与结构分析

为探索A型魏氏梭菌α毒素第56位天冬氨酸(Asp-56)对其生物学活性的影响,将α毒素Asp-56密码子(GAT)定点突变成甘氨酸(Gly-56)密码子(GGT),构建了含α毒素D56G突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G),该突变体蛋白表达量约为22.48%。α毒素和α毒素D56G突变体蛋白的二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成,两者的圆二色(CD)光谱检测有微小变化。生物学活性检测结果表明,α毒素D56G突变体蛋白失去了α毒素的磷脂酶C活性,且α毒素D56G突变体蛋白免疫的小鼠能够保护1MLD的A型魏氏梭菌标准株C57-1毒素攻击。此研究为进一步研究α毒素分子结构与生物学功能的关系奠定了基础。

A型魏氏梭菌α毒素氨基端PLC结构分析与生物学活性鉴定

利用PCR扩增技术克隆A型魏氏梭菌α毒素氨基端的PLC1-250基因,构建含PLC1-250基因表达质粒的BL21(DE3)(p N-PLC1-250)重组菌株,序列分析和酶切鉴定证实构建的p N-PLC1-250重组质粒含有目的基因且基因序列与阅读框架均正确。SDS-PAGE分析表明,PLC1-250蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的18.76%。利用SOPMA法预测PLC1-250蛋白分子的二级结构,且同源模建了其3D结构,结果表明,PLC1-250蛋白分子的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲,三级结构与α毒素相类似。此外,还对其生物学活性进行了鉴定,可为进一步探索α毒素作用的分子机制,以及其分子结构与生物学功能的关系奠定基础。

魏氏梭菌α毒素分子生物学研究进展

对魏氏梭菌α毒素的生物学特性、基因克隆、对细胞和生物膜的作用、表达调控和疾病等方面进行了阐述,以期为α毒素的进一步研究提供参考。

肝特异性表达hNPC1L1转基因巴马小型猪的获得

利用Fu GENE6将线性化的p Liv-11-Neor/Kanr-h NPC1L1转染至小型猪胎儿成纤维细胞,G418筛选和PCR鉴定结果表明,成功获得了肝特异性表达人尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Human Niemann-Pick C1 Like 1,h NPC1L1)转基因小型猪胎儿成纤维细胞。利用体细胞核移植技术将转h NPC1L1基因小型猪胎儿成纤维细胞作为核供体细胞,获得了肝特异性表达h NPC1L1转基因巴马小型猪,并对转基因巴马小型猪进行了基因组水平、转录水平和表达水平检测,同时对目的基因进行了免疫组化定位分析。结果显示,目的基因特异性地表达于肝组织,并且定位于肝小叶间胆管膜上,表明已成功获得了转h NPC1L1基因巴马小型猪,从而为研究尼曼-匹克C1型类似蛋白1(Niemann-Pick C1 Like 1,NPC1L1)在肝中作用的分子机制提供了很好的模型动物。

肝过表达hNPC1L1促进脂质过氧化

利用体细胞核移植技术将构建的肝过表达h NPC1L1的小型猪胎儿成纤维细胞作为核供体细胞,构建了肝过表达h NPC1L1转基因巴马小型猪,PCR和RT-PCR鉴定表明h NPC1L1特异性地表达于肝组织。对转基因巴马小型猪进行了初步研究,脂质过氧化标记物丙二醛(MDA)检测表明:转基因猪MDA含量(7.51±0.09)nmol·m L-1显著高于非转基因猪(3.56±0.16)nmol·m L-1(P<0.001),说明肝组织发生了严重的脂质过氧化。超氧化物歧化酶(SOD)活性检测表明:SOD活性为(131±4.61)U·mg-1显著低于非转基因猪[(229.2±4.39)U·mg-1](P<0.001),说明肝脏清除自由基和抗氧化能力大大下降。试验揭示出在肝脏过表达h NPC1L1导致严重的脂质过氧化,表明NPC1L1在脂代谢紊乱和肝脏疾病中扮演着重要的角色,有望成为肝脏疾病治疗新的靶标。

辽宁部分地区宠物犬犬瘟热病毒分子流行病学调查与分析

为了解犬瘟热病毒（CDV）遗传变异情况，先后从辽宁省沈阳、锦州、辽阳等地区的9个宠物医院收治的临床疑似犬瘟热（CD）病犬中采集了165份拭子样品及组织病料。利用CD抗原检测试纸条、RT—PCR检测方式筛选到8份阳性样品。H基因序列分析结果显示该8株CDV野毒株之间的H基因同源性为97．6％-99．9％，与疫苗（Onderstepoort）同源性为89．1％-90．9％；基因遗传进化显示，该8株毒株属于国内当前流行的Asia-1型，来源于沈阳的SY-35株与在北京发现的CDV强毒株BJ—09在同一进化分枝，其余来源于沈阳、锦州和辽阳的7株与东北地区流行的CDV在同一进化分枝；氨基酸序列比对结果显示，H蛋白在氨基酸235-245，415-425，595-605等处存在高变异，H蛋白3555位置氨基酸的非同义置换概率相对比较高；糖基化位点以及抗原表位预测分析显示该8株CDV的H基因糖基化位点和抗原表位方面均与Asia-1型CDV野毒株相似，但与疫苗株相比变异较大，特别是我们发现JZ-6株丢失了1个潜在N-糖基化位点。结果表明：辽宁地区宠物犬CD流行以Asia-1型CDV为主，不同病毒株间存在遗传多样性。

A型魏氏梭菌α毒素氨基端plc基因的生物学活性探究

为了探究α毒素氨基端及其生物学功能的关系,本研究利用PCR技术克隆了魏氏梭菌α毒素氨基端基因PLC1-250,构建了含PLC1-250基因重组质粒的BL21(DE3)(p N-PLC1-250)重组表达菌株。根据序列分析和酶切鉴定的结果,证实了重组质粒p N-PLC1-250含有PLC1-250基因,且其开放阅读框架和基因序列均正确。经过SDS-PAGE分析,结果表明PLC1-250蛋白表达量约占菌体总蛋白相对含量的18.76%。对其生物学活性的研究表明,PLC1-250蛋白与α毒素一样具有磷脂酶C活性。研究为进一步揭示α毒素的分子作用机制提供了有力的支持。

肝过表达hNPC1L1转基因巴马小型猪的初步研究

研究利用体细胞核移植技术构建了肝过表达h NPC1L1转基因巴马小型猪,由PCR和RT-PCR鉴定表明h NPC1L1在肝组织中特异性地表达。我们对转基因巴马小型猪进行了初步研究,对血清和肝匀浆中的TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT和FFA进行了检测,结果表明转基因猪血清FFA(637.7±9.53)μmol/L显著高于非转基因猪血清FFA(540.4±25.46)μmol/L(p<0.01),转基因猪血清AST(200.8±22.31)U/L显著高于非转基因猪血清AST(92.4±15.55)U/L(p<0.01)。另外,我们对肝中与脂代谢密切相关的基因表达情况进行Real-time PCR检测的结果表明,转基因猪SREBP-1c(3.31±0.18,p<0.05)、FAS(4.49±4.21,p<0.01)显著高于非转基因猪。本研究发现NPC1L1在与脂代谢紊乱密切相关的肝脏疾病中发挥着主导作用,它能通过对脂合成相关基因转录的调控,引发脂代谢紊乱以及肝脏疾病。这说明对NPC1L1的研究有望成为治疗肝脏疾病的新靶标。

肝特异性表达hNPC1L1真核表达载体的构建

为进一步研究NPC1L1在代谢性疾病尤其是脂代谢紊乱中具体的分子机制,本研究以pEGFP-C1质粒为模板,通过PCR扩增出Neo^r/Kan^r基因片段,并对pLiv-11质粒和PCR扩增产物进行酶切,用T4DNA连接酶连接Neo^r/Kan^r、pLiv-11和h NPC1L1基因片段,最终构建了含有表达质粒的重组菌株JM109(pLiv-11-Neo^r/Kan^r-hNPC1L1)。酶切鉴定和序列分析结果表明,构建的p Liv-11-Neo^r/Kan^r-hNPC1L1重组质粒含有hNPC1L1(human Niemann-Pick C1 like 1)基因且基因序列和开放阅读框架均正确。本研究成功构建了肝特异性表达hNPC1L1的真核表达载体,为培育h NPC1L1表达转基因巴马小型猪奠定了一定基础,有利于阐释NPC1L1的调控机制以及揭示肝脂肪代谢相关疾病的发病机制。

H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒株的拯救及初步鉴定

目的探讨H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒的拯救并进行鉴定,为新型流感疫苗的研发奠定基础。方法采用脂质体转染的方法,首先依照A型流感病毒A/PR/8/34 HA嵌合片段的设计对H5 2.3.4.4谱系HA和H7亚型的HA进行改造,利用反向遗传技术拯救A/B型嵌合减毒株,对拯救成功的病毒株进行形态学和分子生物学鉴定,并测定病毒滴度;从中选择H5亚型嵌合减毒株以10~4EID_(50)/50μl的剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,观察、记录小鼠的体重变化及死亡情况,并测定攻毒后第3 d及第6 d小鼠肺脏病毒复制能力。结果成功拯救出2种A/B型嵌合减毒株,分别命名为rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110,测序显示两株嵌合减毒株的序列与预期一致,并在电镜下观察到了流感病毒样粒子。rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110株在MDCK细胞上的病毒滴度均为10^(4.50)TCID_(50)/ml;在鸡胚上的病毒滴度rA/B-H5-NS110为10^(5.25)EID_(50)/ml,rA/B-H7-NS110株为10^(5.44)EID_(50)/ml。小鼠致病性实验中H5亚型嵌合病毒感染组小鼠与对照组相比体重无明显下降,攻毒后小鼠存活率100%;攻毒后第3 d可在小鼠肺脏内检测到嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的轻微复制,第6 d时未检测到病毒复制。结论成功地拯救出2株包含有H5 2.3.4.4谱系HA基因以及H7N9流感病毒HA基因的嵌合减毒株,为B型流感病毒包装机制的研究以及新型流感疫苗的研发提供了新的思路。