沉默大鼠KAT7基因对亚溶解型C5b-9刺激GMC诱导趋化因子MCP-1生成的影响

目的:研究沉默大鼠赖氨酸乙酰基转移酶7(lysine acetyltransferase 7,KAT7)基因对亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular messangial cell,GMC)诱导单核趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-l,MCP-1)生成的影响。方法:针对KAT7基因不同位点,用DNA重组技术设计4个小发夹RNA(short hairpinRNA,shRNA),分别克隆到真核表达载体p GCsi-U6/Neo/GFP/shRNA中。之后,用NeonTM电转仪将上述质粒转染至体外培养的GMC中,再给予sublytic C5b-9刺激。行Western blot实验检查筛选出针对KAT7基因且有最佳沉默效率的shRNA。此外,用real-time PCR和ELISA法分别检测GMC行不同分组处理后MCP-1的mRNA和蛋白水平。结果:核酸测序表明,重组的sh KAT7质粒构建成功。Western blot显示,sh KAT7-2是具备最佳沉默效率的shRNA。用sh KAT7转染GMC后,由sublytic C5b-9刺激GMC诱导的MCP-1基因表达水平显著下降。结论:成功构建了大鼠KAT7 shRNA真核表达质粒,并初步证实KAT7基因的表达能够促进sublytic C5b-9刺激大鼠GMC诱导趋化因子MCP-1的合成与分泌。

苦参碱联合LY294002对人髓系白血病K562细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的探究苦参碱(Mat)联合LY294002对人髓系白血病K562细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及可能机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度Mat单药和联合LY294002对K562细胞增殖的影响;将K562细胞分为对照组、Mat组、LY294002组和Mat+LY294002组,分别采用0.4 g/L Mat及10μmol/L LY294002单独或联合干预48 h后,应用光学显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术annexinⅤ-FITC/PI双标记检测细胞凋亡,PI单标记检测细胞周期变化,Western blot法检测Mat联合LY294002对K562细胞p-mTOR、p-PI3K、Akt、p-Akt、CyclinD1、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达的影响。结果CCK-8结果显示,不同浓度Mat单药和联合LY294002均可抑制K562细胞的增殖,具有时间和浓度依赖性,且联合组增殖抑制率比单药组明显升高(P<0.01)。形态学检查显示,联合用药组比单药组凋亡表现更明显。流式细胞结果显示,与对照组及单药组相比,联合组显著促进细胞凋亡[(42.50±2.63)%,P<0.01],显著增加了细胞周期G0/G1期细胞比率[(57.23±1.44)%,P<0.01]。Western blot结果表明,两药联合后K562细胞p-mTOR、CyclinD1、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平明显增高(P<0.01),Caspase-9蛋白表达水平下降(P<0.01)。结论Mat和LY294002联合应用可以增强对K562细胞生长抑制的协同作用,其机制可能是通过有效下调PI3K/Akt信号通路中的p-Akt表达,使p-mTOR、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达下调,Caspase-9蛋白表达上调来实现的。

临床血液学检验课程创新式教学设计与评价

目的构建“直播+网络学习平台”线上教学模式,以保证临床血液学检验(简称血检)课程教学的顺利进行。方法利用QQ、腾讯课堂等平台进行线上直播授课;课程发布、作业测评、线上考核等环节依托蚌埠医学院网络学习平台。授课教师充分利用已建成的课程、网络学习平台、慕课等资源,在新冠肺炎疫情期间对血检课程重新进行了教学设计,并进行评价。结果共236名医学检验技术专业的本科生参与了线上教学,在为期11周的线上教学中,学生的学习积极性及对血检相关知识点的掌握都非常好。结论“直播+网络学习平台”线上教学模式使血检课程教学有质进行,提高了教学质量。

Sublytic C5b-9刺激上调KLF4促进肾小球系膜细胞生成IL-23的作用

目的:研究转录因子KLF4调控sublytic C5b-9刺激肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)诱导促炎因子白介素-23(IL-23)生成的作用。方法:构建KLF4的短发夹状小干扰RNA(shKLF4)及过表达质粒(pIRES2-KLF4)。将pIRES2-KLF4或shKLF4转染GMC后再行sublytic C5b-9刺激,用qPCR、Western blot和ELISA法检查沉默或过表达KLF4基因后对GMC产生IL-23的影响。此外,构建IL-23基因近端启动子全长质粒,行荧光素酶报告基因实验测定沉默或过表达KLF4基因后对IL-23启动子活性的影响。结果:(1)Sublytic C5b-9刺激GMC后能明显促进IL-23的生成,而沉默KLF4基因后,由sublytic C5b-9诱导GMC产生的IL-23明显减少,但过表达KLF4后IL-23的水平则显著增加。(2)Sublytic C5b-9刺激GMC能显著上调IL-23的启动子活性,而沉默KLF4基因后由sublytic C5b-9诱导的IL-23启动子活性明显降低,但过表达KLF4后又能显著升高IL-23的启动子活性。结论:Sublytic C5b-9刺激诱导IL-23的生成可通过其刺激上调转录因子KLF4的表达而实现。

上调HBO1基因对亚溶解型C5b-9刺激大鼠GMCs生成CCL5的作用机制研究

目的研究上调乙酰基转移酶(HBO1)基因对亚溶解型C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)生成趋化因子CCL5的作用机制。方法构建外源性真核表达重组质粒pIRES2-HBO1,利用NeonTM电转仪将重组质粒转染至体外培养的GMCs中,免疫印迹(WB)实验鉴定外源性过表达HBO1的结果。再进行分组实验(MEM组、pIRES2组、亚溶解型C5b-9组,以及pIRES2-HBO1+亚溶解型C5b-9组)。分别用实时PCR和ELISA法检查不同分组处理后CCL5的mRNA和蛋白水平,并用荧光素酶报告实验检测CCL5的启动子活性情况。结果WB实验表明,真核表达重组质粒pIRES2-HBO1构建成功。用pIRES2-HBO1转染GMCs后,GMCs在亚溶解型C5b-9复合物的刺激下生成CCL5基因的水平及其启动子活性均显著升高。结论成功构建了pIRES2-HBO1真核表达重组质粒,并初步证实HBO1基因表达能够正向调控亚溶解型C5b-9诱导大鼠GMCs生成趋化因子CCL5。

亚溶解型C5b-9刺激GMC诱导KLF4与PCAF结合及结合部位的鉴定

目的:鉴定亚溶解型C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMC)诱导Kruppel样因子4(KLF4)与P300/CBP相关因子(PCAF)相互结合以及结合部位。方法:以亚溶解型C5b-9刺激GMC,应用免疫沉淀(IP)和免疫印迹(IB)法检测KLF4与PCAF相互结合情况。另构建KLF4、PCAF过表达和KLF4、PCAF不同结构域的质粒,将质粒转染GMC,应用IP和IB鉴定KLF4与PCAF的结合部位。结果与结论:亚溶解型C5b-9刺激GMC后能够诱导KLF4与PCAF相互结合,KLF4结合于PCAF转录结合结构域,而PCAF则结合在KLF4的转录激活结构域。

血源性单核巨噬细胞对小鼠脊髓损伤局部巨噬细胞分化的影响

目的:探讨血源性单核巨噬细胞对小鼠脊髓损伤(SCI)局部巨噬细胞分化的影响。方法:将6~8周龄C57BL/6J雌鼠随机分为两组:SCI+PBS脂质体组(SCIP组)、SCI^(+)氯磷酸二钠脂质体(Chlodrolip)组(SCIL组)。两组小鼠分别注射相同剂量两种脂质体。采用流式细胞术(FCM)检测手术前外周血中单核细胞比例,确定单核细胞清除效率。在小鼠T_(10)椎骨处制备SCI重物坠落模型。实验过程中每天对小鼠称重,SCI术后7 d称取两组小鼠脾脏重量;提取损伤脊髓附近浸润的巨噬细胞和小胶质细胞。分别以CD11b、CD68、CCR7的不同荧光抗体组合作为巨噬细胞和小胶质细胞不同状态和亚型的标志。CD68^(+)CD11b^(+)为活化的巨噬细胞和小胶质细胞,CD11b^(+)CD68^(+)CCR7^(+)细胞为M1型巨噬细胞。用FCM检测两组小鼠脊髓损伤部位不同细胞所占比例。结果:SCIP组CD68^(+)细胞占CD11b^(+)细胞百分比例为(48.12±2.70)%,显著低于SCIL组(61.03±3.00)%(P<0.05);CCR7^(+)CD68^(+)细胞占CD11b^(+)细胞百分比例为(43.15±1.79)%,显著低于SCIL组(59.13±1.31)%(P<0.01);SCIL组小鼠体重量和脾脏重量较SCIP组明显下降差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:清除血源性单核巨噬细胞可导致SCI后小鼠体重量及脾脏重量减低,并使脊髓损伤局部巨噬细胞和小胶质细胞向促炎性M1方向极化。