幽门螺杆菌蛋白晶体结构的研究与应用

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，简称H．PY-lori或H声）是微需氧的革兰氏阴性菌，并引起严重的胃十二指肠疾病，例如消化性溃疡、胃炎及胃癌等，WHO将其确定为I类致癌因子^[1]，世界人口中约半数处于慢性感染状态。由于其严重的致病性，近来关于机制的研究及药物开发受到更多的关注，

淀粉样蛋白沉积疾病在细胞水平的研究进展

近些年的研究表明许多神经退行性疾病都与受袭组织和器官中的错误折叠蛋白积聚成淀粉样纤维有关。现结合作者在国内外对于该领域10余年的研究经历及研究成果,针对淀粉样蛋白沉积疾病在细胞内的形成机制、致病机制及调控机制进行阐述,展现了国际上过去几年中对蛋白质错误折叠和积聚的新认识。

幽门螺杆菌CagV蛋白的克隆表达及初步分析

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)IV型分泌系统cagV(hp0530)基因的原核表达系统,表达并纯化CagV蛋白,初步分析其结构和抗原性,为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制和治疗药物的筛选奠定基础。方法以H.pylori ATCC700392株基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增获得目的片段,将其插入表达载体pET28a后转化大肠杆菌BL21(DE3),表达纯化后利用蛋白质印迹(Western blot)分析CagV蛋白的抗原性。结果双酶切鉴定结果证实cagV基因重组表达载体构建成功;重组表达蛋白经飞行质谱鉴定为幽门螺杆菌CagV蛋白;Western blot检测结果显示CagV蛋白具有特异抗原性。结论所克隆表达的CagV蛋白具有较好的抗原性,对后续的的H.pylori致病性和检测、分析研究有比较重要的意义。

幽门螺杆菌唾液酸结合黏附素(SabA)的克隆表达

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称H.pylori或Hp)唾液酸结合黏附素(sialic acid-binding adhe-sion,SabA)的重组质粒,并在大肠杆菌BL21中表达,为探讨SabA的功能及相关疫苗的发展提供帮助。方法以Hp26695株基因组为模板,设计sabA基因特异性引物扩增目的基因,将PCR产物插入到pGEX-4T-1载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达。表达蛋白经飞行质谱鉴定,并用免疫印迹法评价其抗原性。结果经SDS-PAGE和飞行质谱鉴定,该表达蛋白为Hp外膜蛋白SabA,经免疫印法迹检测具有良好的抗原性。结论成功克隆了Hp的SabA,并能在大肠杆菌BL21中表达,该蛋白具有良好的抗原性。

基于超声与地磁检测的闯绿灯检测系统

随着我国汽车保有量的增多,交通拥堵日益明显,严重限制着城市的发展。其中路口的拥堵问题尤为突出,造成路口拥堵的一个重要元凶就是部分车辆在经过路口时存在闯绿灯的违章行为,进而造成了路口内部的混乱,致使车辆在路口的通过率严重下降。文章分析了闯绿灯行为的成因及违章过程,通过应用超声波检测技术与地磁检测技术实现了对该违章行为的检测,配合路口的监控系统可实现对违章行为的取证,完善了交通管理智能化。

大容量天然鸡源噬菌体单链抗体库的构建

目的本研究拟构建大容量天然鸡源噬菌体单链抗体库,用于传染病诊断用抗体筛选。方法选取未经免疫的5周龄白来航鸡包括普通级别和无特定病原体级别、罗曼鸡、洛岛红鸡、洛岛白鸡和贵妃鸡,每个品种各5只,共30只。从法氏囊中提取总RNA,通过反转录合成cDNA。利用聚合酶链式反应技术扩增全套编码抗体可变区的基因序列。通过重叠延伸反应,将重链可变区和轻链可变区基因连接成为单链抗体。将经过回收并酶切纯化的单链抗体克隆到噬菌体载体上,电转化大肠埃希菌TG1感受态细胞。结果成功构建库容量达1010的鸡源天然单链抗体库细胞库,噬菌体展示库滴度达1012菌落形成单位/mL以上。随机挑选165个单克隆进行菌落PCR鉴定,转化阳性插入率为96.97%(160/165);随机选取72株阳性克隆进行测序,抗体互补决定区3碱基序列及长度存在显著差异,表明构建的抗体库多样性良好。结论本研究成功构建了大容量鸡源天然单链抗体库,为后续从中筛选出具有应用价值的特异性单链抗体奠定了基础。

幽门螺杆菌CagA转运相关蛋白CagE、Cagδ及Cagβ的克隆表达及免疫反应性分析

目的构建幽门螺杆菌IV型分泌系统组分中与CagA转运相关蛋白cagE(HP0544)、cagδ(HP0522)及cagβ(HP0524)编码基因重组质粒,在大肠埃希菌中表达并分析表达蛋白的免疫反应性。方法根据在线预测的3种蛋白信号肽及跨膜区特征,以标准菌株HP26695染色体DNA为模板扩增相关蛋白编码片段,与表达载体pET28a及pGEX4t-1连接后转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,分析蛋白表达状态,用Western blot检测表达蛋白与HP26695全菌蛋白免疫血清的反应。结果测序及飞行质谱鉴定表明成功构建CagE、Cagδ及Cagβ的表达载体,其中Cagδ可大量可溶表达,CagE及Cagβ主要以包涵体形式表达。Westernblot显示3种表达蛋白均能被HP26695全菌蛋白免疫血清识别,但Cagδ的免疫反应性较弱。结论成功获得HP26695的与CagA转运相关CagE、Cagδ及Cagβ重组蛋白,其中CagE和Cagβ具有较好的免疫反应性,是潜在的药物靶点和诊断生物标志物。

体外诱导阿莫西林耐药株幽门螺杆菌PBP1突变位点检测

目的分析幽门螺杆菌（Hp）阿莫西林耐药的相关分子机制。方法将Hp接种在含阿莫西林Karmali平板连续传代,诱导阿莫西林敏感菌株Hp 26695产生耐药性,获得耐药株。PCR扩增5种青霉素结合蛋白（PBPs,PBP1~PBP5）,2种Hop孔蛋白（HopB和HopC）和1个外排泵蛋白（HefA）的编码基因,分析耐药菌株与敏感株Hp 26695之间的基因差异。结果获得4株阿莫西林耐药菌株,其中最小抑菌浓度（MIC）为0.5和2 mg/L各1株,MIC为4mg/L 2株;对PCR扩增的基因片段进行测序和比对分析在4个耐药株的PBP1中共检出3个突变位点,2个替代突变（T438M,T593K）和1个插入突变（594G＋）,突变导致的氨基酸变化均位于所有耐药株PBP1的C端转肽酶结构域中。T593K和594G＋是新发现的突变位点。594G＋突变株的MIC为2.0mg/L。T438M和T593K突变增加了594G＋突变株的耐药强度,594G＋合并T438M或T593K突变株的MIC提高到4.0mg/L。结论在体外诱导的阿莫西林耐药株Hp PBP1中检测到3个突变位点,其中2个为新发现突变,Hp对阿莫西林耐药可能与PBP1的上述突变有关,但需要进一步试验验证。

低温冻存对幽门螺杆菌阿莫西林耐药表型的影响分析

目的探讨低温冻存对耐阿莫西林(AMX)的幽门螺杆菌(Hp)阿莫西林耐药表型(AMXR)稳定性的影响。方法以国际标准菌株ATCC 43504及11株中国临床分离株作为出发菌株,经体外压力筛选传代50~60代后成功诱导AMXR,检测其最小抑菌浓度(MIC)。将获得的耐药克隆置-80℃冻存1~3个月后再复苏,比较冻存前后MIC的变化。药敏试验重复2~3次。结果共得到46个AMXR克隆(MIC≥0.5μg/ml)。经-80℃冻存后,其中19个(41.3%)克隆耐药水平显著下降,MIC变化最大者下降率在98%以上。这一变化在各地分离株具有普遍性,在不同耐药水平菌株之间具有差异性。结论AMXR耐药Hp经低温冻存后耐药性下降,且这一现象在高耐药菌株尤为明显。提示在临床上以冻存标本进行的Hp分离培养中,可能存在AMX耐药率和耐药水平的低估。

截短的BabA蛋白结合区(C51)具有促进幽门螺杆菌AGS细胞黏附作用

目的获得能与Lewis b结合的截短的BabA结合域,并评价其对幽门螺杆菌黏附人胃腺癌上皮细胞系(AGS细胞)的影响。方法采用Swiss Model分析蛋白截短后的结构变化,克隆表达截短的BabA结合区蛋白,命名为C51,用Native-PAGE蛋白电泳法检测其是否为多聚体。用流式细胞术检测C51蛋白对J99和M523两株幽门螺杆菌黏附AGS细胞的影响,并用革兰染色观察C51蛋白对幽门螺杆菌聚集的影响。结果体外表达的C51蛋白以多聚体形式存在,该蛋白促进了J99和M523的聚集并使其与AGS的黏附分别增加了12%(t=8.211,P=0.001)和22%(t=4.402,P=0.012)。结论C51蛋白仍保持了与黏附相关的空间结构,并促进了幽门螺杆菌和AGS细胞的结合。

幽门螺杆菌分子伴侣GroEL相互作用蛋白分析

【目的】获得幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)GroEL结合蛋白质组构成谱,为进一步探究GroEL及其与相互作用蛋白在HP致病机制中的作用提供新思路。【方法】在构建HP GroEL原核表达重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)pET-28a(+)-groEL基础上,纯化带有His标签的GroEL蛋白,与HP全菌蛋白提取液共孵育后,利用Protein G磁珠和抗His标签抗体免疫沉淀法对复合物进行捕获,然后对复合物中GroEL及其结合的蛋白质进行质谱法鉴定,根据主要功能对其进行分类,并完成蛋白质相互关系网络分析。【结果】对GroEL蛋白捕获成分进行分析,共鉴定出59种可能与GroEL结合的蛋白质,其中包括19种代谢酶类(KatA、GltA和AhpC等参与氧化还原相关酶类7种,PepA、RocF和HtrA等肽酶5种,以及2种参与脂肪代谢酶、2种参与ATP合成酶、2种尿素酶和HP17_08079蛋白等)、15种外膜蛋白(黏附素BabA、SabA、HapA及其他膜蛋白等)、8种转录翻译相关蛋白(Tuf、RpoBC等)、5种分子伴侣(DnaK、GroES等)、3种细胞毒素相关蛋白(CagA等)、3种氧化还原相关蛋白(TrxA等)、2种信号转导蛋白(TlpB、TlpD)和4种功能尚不明确蛋白。蛋白质相互关系网络分析发现,可形成多个分簇,并以GroEL为网络的中心节点。外膜蛋白,特别是重要黏附素BabA、SabA、HapA等与GroEL的广泛关联,提示GroEL可能在HP与宿主胃黏膜上皮细胞相互作用中发挥重要作用。【结论】HP中GroEL结合蛋白质谱广泛,功能涉及HP代谢、转录翻译、氧化还原和黏附等,并参与HP生存适应、定殖及致病过程。GroEL有望成为一种新的研究HP致病性及发展感染干预策略的重要靶点。

患者胃窦黏膜组织幽门螺杆菌real time-PCR检测与分离培养结果的一致性分析

目的针对胃黏膜组织标本的幽门螺杆菌(HP)感染诊断的real time-PCR检测和分离培养2种最常用方法进行结果一致性分析,为HP感染诊断方法的选择提供科学依据。方法在浙江省4个地区(萧山、温岭、苍南和湖州)各选取1所医院,采集2020年11月16日至12月7日送至杭州致远检验医学研究所进行HP分离培养和耐药性分析的全部患者胃窦部黏膜活检标本,共1312份。每份样本经研磨匀浆处理后分为2份,分别用于常规HP分离培养和real time-PCR检测(以cagH为检测靶点),2种方法平行双盲进行。检测结果的一致性及不同医院来源样本间的差异用χ^(2)检验、Fisher精确检验以及独立样本t检验等统计学方法进行分析。结果1312份样本中,分离培养法和real time-PCR法的阳性率分别为29.34%(385/1312)、28.51%(374/1312),差异无统计学意义(P=0.636)。来自4所医院的标本,2种方法的检出率差异均无统计学意义(P=0.075),二者在萧山某院、温岭某院、苍南某院、湖州某院样本以及总体样本中的Kappa值分别为0.84、0.89、0.75、0.91、0.85。real time-PCR法的灵敏度和特异度分别为89.26%、100.00%。在real time-PCR法检测阳性而培养阴性的样本中,检测Ct值为25.47~34.97,均值为30.90,90%的Ct值均≤34.46,频数最高组为29.00~30.00组。结论分离培养法和real time-PCR法在临床胃黏膜标本HP诊断中均可达到较高的检测效能,且2种方法检出结果一致性良好,可应用于HP个体化治疗,以便在做出HP感染诊断的同时提供受检者的药敏检测结果。标本中HP菌量及标本的保存运输条件可能对结果产生重要影响。

金黄色葡萄球菌类肠毒素W的超抗原活性位点预测与克隆表达

目的预测金黄色葡萄球菌类肠毒素W(SElW)与T细胞受体(TCR)的对接和超抗原活性位点,并对SElW进行克隆表达和纯化。方法利用AlphaFold对SElW蛋白单体进行三维结构预测,借助SAVES在线服务器使用ERRAT、拉氏图和Verify_3D等软件对蛋白模型进行评估。用ZDOCK服务器模拟SElW与TCR的对接构象,并对SElW与其他肠毒素的氨基酸序列进行比对。设计引物扩增selw基因,将该片段重组于pMD18-T载体中并进行测序;经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切后将目的片段重组于表达质粒pET-28a(+)中,重组质粒鉴定后用IPTG诱导表达;用亲和层析法对表达于上清中的SElW蛋白进行纯化,用BCA法对蛋白进行定量。结果三维结构预测结果显示,SElW蛋白由氨基末端和羧基末端两个结构域组成,其中氨基末端结构域由3个α-螺旋和6个β-片层组成,羧基末端结构域由2个α-螺旋和7个反向平行的β-片层组成。SElW蛋白模型的整体质量因素得分为98.08,其中93.24%的氨基酸Verify_3D得分≥0.2,且无氨基酸位于不允许区。模拟对接预测选择评分最高的对接构象(评分值为1521.328)作为分析对象,采用PyMOL软件分析SElW与TCR之间形成的19个氢键。结合序列比对和既往研究结果,本研究预测发现了SElW蛋白的5个重要超抗原活性位点,分别是Y18、N19、W55、C88和C98。通过克隆表达和蛋白纯化,获得了高纯度的可溶性重组蛋白SElW。结论研究预测了SElW蛋白中5个可能的超抗原活性位点,成功构建并表达了SElW蛋白,为进一步探索SElW免疫识别机制奠定了基础。