微小隐孢子虫表面抗原CP23基因的克隆及表达

目的构建微小隐孢子虫表面抗原CP23基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法用微小隐孢子虫卵囊感染免疫抑制BALB/c小鼠,用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化微小隐孢子虫卵囊,用酚-氯仿抽提法提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,然后克隆至TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将CP23基因片段用限制性内切酶切下克隆至pET-30a(+)载体,构建pET-30a-23质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果扩增出约340bp的微小隐孢子虫CP23基因片段并成功构建pET-30a-23质粒,表达出分子质量单位为27ku的融合蛋白,Western blot显示该蛋白能被抗微小隐孢子虫血清识别。结论成功构建pET-30a-23质粒,表达产物具有免疫反应性,为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制打下了基础。

分子生物学技术在隐孢子虫病研究中的应用进展

隐孢子虫是一种属于顶端复合物门的寄生性原虫,感染此虫引起的隐孢子虫病是一种全球性的人畜共患寄生虫病。免疫力低下、功能缺陷或免疫抑制的患者感染此虫后,可引起严重胃肠炎并伴有水样腹泻,导致大量体液丢失而危及生命。艾滋病患者中感染率高达48%左右,长期的严重腹泻是艾滋病病人的重要致死因素之一。该病对人类公共卫生造成很大威胁,国外暴发流行时有报告。国内外一些学者相继利用核酸限制性片段长度多态性分析、基因克隆、分子杂交和聚合酶链式反应等分子生物学技术,对隐孢子虫核酸分子进行了大量的研究并取得了一些重要进展,并在隐孢子虫卵囊检测、隐孢子虫病的诊断、流行病学调查及虫种鉴定和虫株分型中得到广泛应用。

刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文)

目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2(ROP2)靶基因,构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物,应用PCR扩增ROP2基因片段,回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T;用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子,将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3,并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。结果以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7kbROP2基因片段,克隆于pUCm-T载体中,再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3,经筛选鉴定,构建pc-DNA3-ROP2重组质粒;测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。结论弓形虫ROP2基因片段,经TA克隆及亚克隆,构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。

隐孢子虫病免疫诊断研究进展

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种全球性的人畜共患寄生虫病,其病原体是一种属于顶端复合物门的寄生性原虫--隐孢子虫(Cryptosporidium).隐孢子虫是Tyzzer于1907年首先在实验小鼠胃肠道内发现的,但直到80年代以后才逐渐引起重视.当前认为有效的隐孢子虫种类有:微小隐孢子虫(C.parvum),小鼠隐孢子虫(C.muris),火鸡隐孢子虫(C.meleagridis),贝利隐孢子虫(C.baileyi),蛇隐孢子虫(C.serpntis),和鱼隐孢子虫(C.nasorum)等,对人造成感染的主要是微小隐孢子虫.隐孢子虫的生活史简单,不需要转换宿主即可完成,生活史有无性生殖、有性生殖和孢子生殖三个阶段,均在同一宿主体内进行.本虫寄生于肠粘膜,使上皮细胞表面凹陷、老化和脱落,破坏了肠绒毛的正常功能,影响消化吸收而发生腹泻.

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达(英文)

目的构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2(ROP2)和主要表面抗原1的重组表达质粒,纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18-T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定,将pMD-ROP2中ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切、连接等反应,亚克隆入pET-30a(+)原核表达载体,构建pET-ROP2载体,然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoⅠ和EcoRⅠ酶切的pET-30a(+)载体连接,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Western blot分析。结果从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

刚地弓形虫P30(SAG1)重组抗原的高效表达和体外纯化(英文)

目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础。方法PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+)构建重组载体,将其转化到DH5α中。经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。大量的诱导表达产物用SNBC3S NTA Resin方法纯化并进行复性。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组表达融合蛋白量单位为30ku,与理论值相符。结论成功构建重组体,获得纯化和复性的弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。

扩张型心肌病与Th1/Th2细胞因子失衡的研究

目的探讨Th1/Th2细胞因子失衡与扩张型心肌病(DCM)之间的关系。方法用RT-PCR方法检测DCM患者与健康对照者外周血单个核细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10 mRNA的表达水平,比较DCM患者与健康对照者之间IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10 mRNA的表达变化之间的关系。结果DCM组Th1/Th2比值明显低于对照组(P均<0.05),IL-4和IL-10表达较对照组明显增高,而IFN-γ和IL-2较对照组表达明显降低。结论DCM组存在Th1细胞向Th2细胞漂移现象,Th2细胞介导的体液免疫应答在DCM发病机理中起优势作用。

微创颅脑穿刺引流治疗双侧慢性硬膜下血肿48例

目的探讨微创治疗双侧慢性硬膜下血肿疗效及注意事项。方法48例双侧慢性硬膜下血肿患者均采用YL-1型一次性颅内血肿粉碎穿刺针治疗,在CT下定点,选用合适长度穿刺针,用电钻将穿刺针钻入血肿部位,引流冲洗,24～48h复查CT满意后拔出穿刺针,术中注意穿刺针深度、引流速度及引流量。结果本组48例慢性硬膜下血肿行微创颅内血肿清除术后,有意识障碍的患者均在12h内意识转清,其余症状均逐渐消失,住院时间4～7d,平均5d。无一例死亡,无一例发生脑损伤、颅内感染、急性硬膜外及颅内血肿、张力性气颅。患者全部治愈,恢复良好。结论微创引流术治疗双侧慢性硬膜下血肿操作简单,创伤小,痛苦轻,恢复快,疗效佳,适合在基层医院开展。

结肠息肉内镜下治疗的并发症分析

目的 分析内镜下治疗结肠息肉的各种并发症发生情况。方法 2156例行无痛电子结肠镜检查并行内镜下治疗的结肠息肉患者,观察患者术后并发症发生情况,对比不同性别、年龄、手术史、息肉数目及操作方式患者术后并发症发生情况。结果 2156例患者中,95例(4.41%)出现并发症,其中出血36例(1.67%),穿孔4例(0.19%),腹痛34例(1.58%),感染21例(0.97%),无一例死亡。不同性别患者术后并发症发生率比较差异无统计学意义(P>0.05);年龄≥60岁患者术后并发症发生率5.62%高于年龄<60岁患者的3.55%,差异具有统计学意义(P<0.05);有手术史患者术后并发症发生率8.53%高于无手术史患者的4.14%,差异具有统计学意义(P<0.05);息肉数目≥2枚患者术后并发症发生率4.86%高于息肉数目1枚患者的1.84%,差异具有统计学意义(P<0.05)。行活检钳钳除术患者的并发症发生率均低于行氩气刀烧灼术、高频电切术、圈套器勒除术、注射后高频电切术、内镜下黏膜切除术(EMR)/内镜黏膜下剥离术(ESD)患者,行氩气刀烧灼术、高频电切术、圈套器勒除术、注射后高频电切术患者的并发症发生率均低于行EMR/ESD患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 结肠息肉内镜下治疗术后并发症的发生与患者年龄、是否有手术史、息肉数目、不同操作方式等因素有关,患者年龄越大、术前有手术史、多发息肉等术后并发症发生率较高,EMR/ESD术后并发症发病率明显高于其他操作方法。因此,合理选择病例、根据患者及结肠息肉的具体情况选择合适的操作方式可以有效降低和防止并发症的发生。

无创机械通气治疗重症急性左心衰竭的疗效分析

目的观察无创机械通气（NPPV）治疗重症急性左心衰竭的临床效果。方法33例重症急性左心衰竭患者在常规吸氧、药物治疗的基础上，使用呼吸机予以面罩无创机械通气治疗，选择压力支持＋呼气末正压（PSV＋PEEP）通气模式。观察NPPV组与常规治疗（RT）组患者在治疗前后临床症状改善情况、心率（HR）、呼吸频率（RR）、平均动脉压（MAP）、血气分析（pH、PaO2、PaCO2、SpO2）及病死率和住院时间。结果NPPV组患者在实施机械通气2h后肺部啰音明显减少或消失。2h后复查血气分析，结果显示全部患者均有不同程度的好转。有3例患者终因心衰不能纠正而死亡。与常规治疗组及治疗前相比，NPPV组机械通气治疗后，患者呼吸困难明显改善，生命体征很快稳定，血气分析指标明显好转（P均〈0．05）。两组病死率、住院时间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论NPPV治疗重症急性左心衰竭能迅速改善患者的临床症状和低氧血症，可以提高抢救成功率，缩短住院时间，是抢救重症急性左心衰竭安全有效的辅助措施。