HSV-TK/CD20双自杀基因系统慢病毒载体的构建及应用

目的构建同时表达单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和RQR8膜蛋白双自杀可控开关的Jurkat细胞,使之可通过更昔洛韦药物(GCV)或利妥昔单抗(RTX)实现可控性细胞消除。方法 RQR8膜蛋白小分子含利妥昔单抗识别的模拟表位和抗CD34单抗表位。合成编码RQR8及HSV-TK的基因,构建慢病毒共表达载体pLV-RQR8-T2A-TK;脂质体Lipofectamine3000转染Jurkat细胞,流式荧光抗CD34单抗检测RQR8的表达,通过磁珠筛选获得RQR8+TK+Jurkat细胞;分别加入GCV或RTX检测自杀可控开关功能:CCK8法检测加药后细胞增殖情况,Annexin-V/PI检测细胞凋亡情况。结果慢病毒载体pLV-RQR8-T2A-TK酶切片段大约1 670 bp,测序进一步证实外源片段插入正确。慢病毒感染Jurkat细胞,感染率为45.21%,磁珠纯化得到99.4%纯度的RQR8+TK+Jurkat。GCV对RQR8+TK+Jurkat具有细胞毒性作用,GCV浓度为40μmol/L时,其存活率为(52.11±7.04)%,IC50为20.66μmol/L。80μmol/L GCV作用RQR8+TK+Jurkat细胞72 h后凋亡率达(41.28±2.78)%。在血清(含补体)存在情况下,320μg/ml RTX可通过补体介导的细胞杀伤作用杀伤RQR8+TK+Jurkat,其存活率为(29.64±4.52)%。结论双自杀可控开关慢病毒载体pLV-RQR8-T2A-TK构建成功,加入GCV或RTX可通过2种不同路径成功杀伤细胞,达到细胞清除目的,提高了安全性,为临床治疗过继免疫不良反应提供多种选择。

环黄芪醇联合IL-7和IL-15对人脐带血T细胞体外扩增的影响

目的探究环黄芪醇(cycloastragenol,CAG)联合细胞因子IL-7和IL-15对人脐带血T细胞体外扩增和CD8^+T细胞亚群中干细胞样中心记忆性T细胞(stem cell-like central memory T cells,TSCM)比例的影响,为基于T细胞的肿瘤细胞免疫治疗研究奠定实验基础。方法采集健康产妇脐带血,通过密度梯度离心法分离获得脐带血单个核细胞(umbilical cord blood mononuclear cells,UCBMC),利用CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激活化后,采用不同浓度的CAG(0、0.04、0.2、1、5μmol/L)联合IL-7和IL-15连续培养,利用多色流式细胞术分别测定T细胞的增殖程度以及CD8^+T细胞中TSCM比例的变化情况。结果 0.2μmol/L CAG与IL-7和IL-15细胞因子联用组促T细胞扩增作用显著高于其他浓度CAG与细胞因子IL-7和IL-15联用组或单独使用细胞因子IL-7和IL-15组。同时,0.2μmol/L CAG联用IL-7和IL-15组还可以促进CD8^+T中CD197^+CD45RA+细胞表型的表达,即维持CD8^+T中高比例的TSCM亚群。结论 0.2μmol/L CAG联合IL-7和IL-15可以显著提高活化T细胞扩增能力,并能保持CD8^+T细胞中高比例的TSCM亚群。

质粒电穿孔Jurkat细胞递送CRISPR/Cas9系统的优化

CRISPR/Cas9是一种应用广泛的高效基因编辑技术。运用CRISPR/Cas9对T细胞进行基因修饰能增强T细胞的特异性免疫应答能力,在过继性肿瘤免疫T细胞治疗中具有巨大应用前景。CRISPR/Cas9的递送途径及效率影响着其基因编辑的效率。电穿孔是一种安全、简单、经济、高效、适用范围广和重复性好的转染方法,可用来高效递送CRISPR/Cas9系统。本研究以常用的T淋巴细胞系癌细胞Jurkat细胞为T细胞模型材料,利用绿色荧光蛋白基因质粒观测转染效率,探索质粒电穿孔Jurkat细胞的最优体系,进一步采用该优化体系成功递送CRISPR/Cas9系统进入Jurkat细胞,高效地敲除目的β2M基因,使之成为HLA-I^-Jurkat细胞。该研究提供了适用于质粒CRISPR/Cas9系统电穿孔T细胞的优化系统,为后续将CRISPR/Cas9基因编辑系统运用于过继性T细胞肿瘤治疗奠定了基础。