两种铁皮石斛总RNA提取方法的比较研究

铁皮石斛是我国重点保护药材,因其富含多糖及次生代谢物,用普通的方法难以从叶中提取到能满足构建全长cDNA文库等分子生物学实验对高质量RNA需要的总RNA。分别通过对异硫氰酸胍法和CTAB法进行改良。异硫氰酸胍法:往裂解液中加入PVP,通过PVP去除多酚;用56℃热水水浴5min加速组织细胞裂解;抽提时间由原来15 min缩短为5min;根据材料多糖多酚的多寡情况适当增加裂解液。CTAB法:根据材料多糖多酚的多寡情况适当增加CTAB裂解液;用LiCl对RNA进行选择性过夜沉淀;灵活处理,适当增大LiCl浓度。结果表明用改良后的2种方法均可提取到总RNA,经对比发现,改良CTAB法提取效果更好,可重复性强,抽取到的RNA更适合于后续的分子生物学实验。

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析

目的:为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。方法:以SMART(switching mechanism at5'end of RNA transcript)方式合成全长cDNA,结合DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA文库。结果:该文库重组率为93.9%,文库滴度1.3×106cfu.mL-1,插入片段平均大小1.5 kb左右。随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序,通过生物信息学分析,获得150个单一序列,其中147个序列与相应的同源蛋白匹配,GO(geneontology)分类表明这些序列参与各种生化途径。8个序列包含了完整编码框,可判断为全长基因。结论:成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA文库,为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。