粉葛水提物对2型糖尿病db/db小鼠胰岛细胞炎症损伤的改善作用及其机制

为探讨粉葛水提物对2型糖尿病db/db小鼠胰岛细胞炎症损伤的作用及机制,将30只db/db小鼠随机分为模型组、粉葛水提物高、中、低剂量组和二甲双胍组,正常组则采用6只db/m小鼠。持续给药8周后,测量小鼠体质量变化、计算胰重比、检测血清空腹胰岛素(fasting serum lisulin,FINS)、血清空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血清蛋白(glycosylated serum protein,GSP),计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assess-ment for insulin resistance,HOMA-IR);苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察胰腺组织病理学变化;免疫组化(immunohistochemistry,IHC)法检测胰岛细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、核因子-κBp65(nuclear factor kappa-Bp65,NF-κBp65)和白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的蛋白表达;蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测胰腺组织寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(cystein-asparate protease 1,caspase-1)、白细胞介素1β(interle-ukin-1β,IL-1β)、IL-18的蛋白表达;免疫荧光(immunofluorescence,IF)法检测胰腺组织NLRP3的表达。结果表明:与正常组比较,模型组小鼠体质量、胰重比、血清GSP、FBG、FINS含量、HOMA-IR水平明显增加;胰岛细胞变形,出现炎性浸润,胰岛细胞和腺泡细胞边界不清晰,TNF-α、NF-κBp65和IL-18的蛋白表达量明显增加;胰腺组织中相关蛋白表达量明显升高。与模型组比较,二甲双胍和粉葛水提物组体质量、胰重比、血清GSP、FBG、FINS明显降低;胰岛细胞形态完整且边界清晰,炎性浸润明显降低,可见较多胰岛细胞,TNF-α、NF-κBp65和IL-18的蛋白表达量明显减少;胰腺组织中相关蛋白表达量明显降低。综上,粉葛水提物可以减轻db/db小鼠胰岛细胞的炎症损伤,降低胰岛素抵抗,改善2型糖尿病症状。其作用机制可能与抑制NLRP3炎性小体通路及其下游炎症因子IL-1β和IL-18的分泌有关。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨补阳还五汤调控巨噬细胞极化的作用机制

目的:基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)通路探讨补阳还五汤调控巨噬细胞极化的作用机制。方法:本实验通过采用不同浓度(0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 mg·L^(-1))脂多糖(LPS)对RAW264.7巨噬细胞干预24 h,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适浓度建立体外LPS诱导RAW246.7巨噬细胞炎症模型。将实验分为空白组(20%空白血清),模型组(20%空白血清+10 mg·L^(-1)LPS),模型对照组(20%FBS+10mg·L^(-1)LPS),低、中、高(5%、10%、20%)补阳还五汤含药血清组及NLRP3抑制剂MCC950(50μmol·L^(-1))、活性氧(ROS)抑制剂NAC(10μmol·L^(-1))、NF-κB抑制剂PDTC(10μmol·L^(-1))联合补阳还五汤高剂量(20%)组。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测RAW264.7巨噬细胞白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况;流式细胞术检测巨噬细胞ROS水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测M1型巨噬细胞相关细胞因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、M2型巨噬细胞相关细胞因子精氨酸酶1(Arg-1)、白细胞介素-10(IL-10)蛋白表达,TLR4/NF-κB/NLRP3通路的相关蛋白表达。结果:CCK-8结果显示,在10 mg·L^(-1)LPS的刺激下,RAW264.7巨噬细胞的细胞活力值最高(P<0.01)。与空白组比较,模型组IL-1β、IL-18、TNF-α水平显著升高(P<0.01);ROS表达量显著上升(P<0.01);M1型巨噬细胞iNOS、TNF-α蛋白表达显著升高(P<0.01),M2型巨噬细胞Arg-1、IL-10蛋白表达显著降低(P<0.01);TLR4、髓样分化因子88(Myd88)、磷酸化核转录因子-κB抑制蛋白(p-IκB)/核转录因子-κB抑制蛋白(IκB)、磷酸化核转录因子-κB(p-NF-κB)p65/NF-κB p65、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1前体(pro-Caspase-1)蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,补阳还五汤各给药组及抑制剂组均可明显降低IL-1β、IL-18、TNF-α水平(P<0.05,P<0.01),抑制RWA264.7巨噬细胞炎症因子的表达;降低细胞ROS表达水平(P<0.01);下调M1型巨噬细胞iNOS、TNF-α蛋白(P<0.01),上调M2型巨噬细胞Arg-1、IL-10蛋白表达(P<0.05,P<0.01);降低TLR4、Myd88、p-IκB/IκB、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:补阳还五汤可改善巨噬细胞炎症反应,可能与降低巨噬细胞ROS水平,抑制RAW264.7巨噬细胞极化,下调TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达水平有关。

基于肠道菌群分析探讨葛根减轻T2DM db/db小鼠胰岛素抵抗的作用及机制

基于肠道菌群分析探讨葛根对2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)db/db小鼠胰岛素抵抗的作用及可能机制。将50只db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组以及葛根高、中、低剂量组,另取10只db/m小鼠为正常组。持续给药8周,测量小鼠体质量和血糖;酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测糖化血清蛋白(glycosylated serum protein,GSP)、血清空腹胰岛素(fasting serum lisulin,FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);HE染色观察胰腺组织病理学变化;免疫组化检测胰腺肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达;16S rRNA技术检测正常组、模型组和葛根中剂量组小鼠粪便肠道菌群结构变化;蛋白免疫印记法检测回肠组织中法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)、G蛋白胆汁酸偶联受体5(takeda G protein-coupled receptor 5,TGR5),肝组织中胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)、甾醇27α-羟化酶(sterol 27α-hydroxylase,CYP27A1)和结肠组织中G蛋白偶联受体41(G protein-coupled receptor 41,GPR41)、G蛋白偶联受体43(G protein-coupled receptor 43,GPR43)的表达。与正常组比较,模型组小鼠体质量、血糖、血清GSP、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、FINS显著增加,HOMA-IR指数显著上升;胰岛细胞炎性浸润,大量腺泡细胞坏死变性,胰岛细胞和腺泡细胞边界不清晰;肠道菌群发生紊乱;组织中FXR、TGR5、CYP7A1、CYP27A1、GPR41和GPR43蛋白表达显著降低。与模型组比较,二甲双胍组、葛根组小鼠体质量、血糖、血清GSP、FBG、FINS显著降低;胰岛细胞形态完整呈团状边界清晰,少量腺泡细胞坏死,可见较多胰岛细胞;葛根中剂量组肠道菌群从门到属水平均发生了变化,影响肠道菌群代谢物的菌群相对丰度增加;组织中FXR、TGR5、CYP7A1、CYP27A1、GPR41和GPR43蛋白表达显著升高。综合实验结果发现,葛根可改善T2DM db/db小鼠胰岛细胞的炎症损伤,减轻胰岛素抵抗,其作用机制可能与增加肠道中放线菌门、双歧杆菌、拟杆菌属丰度和肠道菌群代谢物相关蛋白表达有关。

基于NLRP3炎症小体探讨参苓白术散治疗溃疡性结肠炎的作用机制

基于NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermoprotein domain 3,NLRP3)炎症小体信号通路探讨参苓白术散(Shenling Baizhu Powder)对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)模型小鼠的作用机制。70只SPF级BALB/c小鼠适应性喂养3 d后,随机分为7组:正常组、模型组、美沙拉嗪组、NLRP3抑制剂MCC950组以及参苓白术散高、中、低剂量组,每组10只。正常组自由饮用双蒸水,其余各组自由饮用葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)诱导BALB/c小鼠建立急性UC模型,造模的同时开始灌胃给药,为期1周。实验期间对各组小鼠一般精神状态和疾病活动情况进行记录,并统计评分。实验结束后,收取结肠和血清,使用HE染色法观察结肠组织病理变化,酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测小鼠结肠组织中白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和血清中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)水平的变化情况,免疫荧光法、免疫组化法分别检测结肠组织中NLRP3、IL-18的表达情况,蛋白免疫印迹法检测结肠组织蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(cystein-asparate protease 1,caspase-1)及其相关下游炎症因子的表达水平,以此探讨参苓白术散治疗UC的作用机制。与正常组相比,模型组小鼠疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分、结肠病理损伤评分、血清中炎症因子IL-1β、结肠炎症因子IL-18和MPO含量都显著增加(P<0.05,P<0.01);结肠组织出现明显的病理学改变,其炎症因子表达含量升高,结肠中NLRP3、caspase-1、ASC、pro-IL-1β、cleaved-IL-1β、pro-IL-18、cleaved-IL-18蛋白表达显著上调(P<0.01)。与模型组相比,各给药组的DAI评分、病理学损伤评分、血清中炎症因子IL-1β、结肠炎症因子IL-18和MPO的表达均降低,结肠中NLRP3、caspase-1、ASC、pro-IL-1β、cleaved-IL-1β、pro-IL-18、cleaved-IL-18蛋白表达显著下调(P<0.05,P<0.01)。基于前期研究基础结合该实验结果发现,参苓白术散可改善由DSS诱发的UC炎症反应,改善肠道损伤情况,其作用机制可能与调控NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白及其相关炎症因子有关。

葛根抑制高糖诱导巨噬细胞损伤与调控内质网应激信号通路的关系探讨

目的:观察葛根含药血清对高糖诱导的重度内质网应激(ERS)模型中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、内质网应激信号通路蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、活化转录因子4(ATF4)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)的作用,观察葛根对高糖诱导巨噬细胞炎症损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:采用血清药理学方法,制备空白血清和葛根含药血清,体外培养RAW264.7巨噬细胞,采过62.5 mmol·L^(-1)葡萄糖诱导巨噬细胞建立体外重度ERS模型,使用不同体积分数的葛根含药血清及内质网应激抑制剂(4-PBA)干预细胞。通过细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测不同葡萄糖浓度(22.5、23.5、25.0、27.5、32.5、47.5、72.5、122.5 mmol·L^(-1))及不同体积分数葛根含药血清(0%、2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%)对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响;在CCK-8法检测葡萄糖浓度对巨噬细胞存活率影响结果基础上采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同葡萄糖浓度浓度(22.5、32.5、42.5、52.5、62.5、72.5 mmol·L^(-1))及不同时间段下(6、12、24、36、48 h)ERS的标志性蛋白GRP78的表达量,筛选出建立重度ERS模型最适造模浓度和时间,基于上述实验结果将细胞分为分别将细胞分为空白组、62.5 mmol·L^(-1)葡萄糖模型组、2 mmol·L^(-1)4-PBA组、高、中、低(15%、10%、5%)葛根含药血清组开展后续实验,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测重度ERS模型中RAW264.7巨噬细胞上清液中TNF-α的表达,Western blot检测重度ERS模型中相关通路蛋白表达情况。结果:CCK-8法检测发现,在葡萄糖浓度为27.5 mmol·L^(-1)刺激下巨噬细胞存活率达到最高(P<0.01)、而在葡萄糖浓度22.5~27.5 mmol·L^(-1)刺激下,巨噬细胞存活率随浓度增加而呈上升趋势,葡萄糖浓度在25.0 mmol·L^(-1)时差异有统计学意义(P<0.01),在葡萄糖浓度37.5~122.5 mmol·L^(-1)刺激下,则出现了下降趋势,葛根含药血清在1%~15%皆差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),Western blot法检测不同葡萄糖浓度和不同时间段下的GRP78蛋白表达量发现,在24 h时,GRP78蛋白表达显著性最强(P<0.01),葡萄糖浓度为62.5 mmol·L^(-1)时,GRP78蛋白表达量最强(P<0.01);由此可知葡萄糖浓度为62.5 mmol·L^(-1)可作为诱导重度ERS模型的最适浓度。与空白组相比较,模型组中TNF-α、GRP78、ATF4蛋白表达水平,磷酸化(p)-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α明显升高(P<0.05,P<0.01),而与模型组比较,各给药组的TNF-α、GRP78、ATF4蛋白表达水平,p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:在体外实验结果表明,葛根在一定程度上可缓解高糖诱导巨噬细胞所出现的炎症损伤及通过抑制ERS信号通路中GRP78、ATF4、PERK、eIF2α的表达,以此来恢复细胞稳态。

补阳还五汤调控衣霉素诱导的ApoE^(-/-)小鼠内质网应激从而减少动脉粥样硬化易损斑块面积

目的基于IRE1-XBP1通路探究补阳还五汤(BYHWT)抑制由衣霉素诱导的载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE^(-/-)小鼠)内质网应激从而提高动脉易损斑块稳定性的作用及机制。方法高脂饲料喂养ApoE^(-/-)小鼠12周制备动脉粥样硬化(AS)模型,在AS模型基础上腹腔注射衣霉素0.9 mg·kg^(-1)。造模后将小鼠分为模型组,4-PBA组(给药剂量为0.5 g·kg^(-1)),补阳还五汤低、中、高剂量组(给药剂量为5、10、20 g·kg^(-1)),每组10只,继续高脂喂养。以相同遗传背景非转基因小鼠(C57BL/6J小鼠)作为正常对照组(给蒸馏水),给予普通饲料喂养。8周后收集主动脉进行苏木素-伊红染色观察;TUNEL法检测主动脉内细胞凋亡情况;ELISA法检测血清白细胞介素1β(1L-1β)和白细胞介素6(IL-6)的水平;Western Blot法检测内质网应激标志性蛋白内质网分子伴侣糖调节蛋白(GRP78)、内质网跨膜激酶1(IRE1)、X盒结合蛋白(XBP1)及凋亡相关蛋白Bcl-2相关X蛋白(BAX)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达量。结果与正常组比较,模型组斑块面积明显增加;与模型组比较,4-PBA组与补阳还五汤低、中、高剂量组血管内斑块均有减少,主动脉斑块内细胞凋亡率下降(P<0.01)。与正常组比较,模型组IL-6与IL-1β水平均升高(P<0.01);与模型组比较,补阳还五汤高剂量组及4-PBA组IL-1β水平均下降(P<0.05),补阳还五汤低、中、高剂量组及4-PBA组IL-6水平均下降(P<0.05)。与正常组比较,模型组内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1、XBP1相对蛋白表达含量均有上升(P<0.05);与模型组比较,补阳还五汤低、中、高剂量组及4-PBA组内质网应激标志性蛋白GRP78、IRE1、XBP1相对蛋白表达量均有下降(P<0.05)。与正常组比较,模型组凋亡蛋白BAX与CHOP相对表达量均明显上升(P<0.05),Bcl-2相对表达量下降(P<0.05);与模型组比较,补阳还五汤中、高剂量组与4-PBA组BAX、CHOP相对表达量均有下降(P<0.05),Bcl-2相对表达量上升(P<0.05)。结论补阳还五汤可通过抑制由衣霉素造成的内质网应激从而减少ApoE^(-/-)小鼠AS易损斑块面积。