EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立

目的建立以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测猪细小病毒(PPV)的方法,为血液制品中病毒去除效果的工艺验证提供高效准确的技术平台。方法根据PPV的VP2基因保守序列,设计并合成引物。对目的片段进行PCR扩增,将扩增的PPV病毒VP2基因片段克隆入PMD19-T载体,重组质粒PMD19-T-VP2经测序鉴定正确后,作为标准品模板,用于标准曲线的绘制和该实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性检测的材料。结果应用重组质粒PMD19-T-VP2制作的荧光定量PCR扩增曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系;该方法检测灵敏度的下限能达到102copies/μl;与其他DNA病毒和同种属的细小病毒无明显的交叉反应;连续重复检测高、中、低浓度样品,批内批间变异系数小,重复性好。结论以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测PPV的方法提高了检测灵敏度,缩短了工艺验证的时间。

病毒灭活技术及产业发展报告

1国际病毒灭活技术及产业发展现状1.1产业规模和产值生物制品的原材料主要来源于血液及哺乳动物细胞培养产物。由于其具有病原体传播的风险,因此在生产过程中需要应用病毒灭活工艺来保障生物安全。不同的制品因工艺的差异也决定了病毒灭活策略的选择。血液是一种不可替代的重要的治疗资源。

高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体细胞株的建立及其表达产物的分析

目的建立高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体的工程细胞株。方法将构建的抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因真核表达载体转染CHO细胞,并采用DHFR/MTX基因扩增策略,经反复加压和克隆筛选,提高抗体的表达量。用ELISA、Westernblot和体外中和试验分析比较抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体与鼠亲本单抗的特性。结果获得的表达抗人TNF-α嵌合抗体的转染细胞系2F5,在静止培养4d后工程抗体的表达量约80mg/L。所表达的工程抗体优于鼠亲本单抗F7/2,并具有良好的特异性和中和活性,其相对亲和力约为2.1×10-10mol/L。结论已成功建立了高表达的嵌合抗体工程细胞株,其抗体具有潜在的临床应用前景。

S/D法和低pH孵放法在富含IgM免疫球蛋白中脂包膜病毒的灭活研究

目的以水泡性口炎病毒(VSV)、辛德毕斯病毒(Sindbis)和伪狂犬病毒(PRV)为指示病毒,验证S/D和低pH孵放2种处理方法对富含IgM制剂的脂包膜病毒灭活效果。方法将指示病毒加入富含IgM制剂中,在无保护剂状态下,分别经S/D和低pH孵放处理后,测定残余病毒滴度,以病毒滴度下降数代表灭活效果。结果 S/D法使PRV和Sindbis的病毒滴度下降分别为2.94和5.25 Logs;低pH孵放使PRV和VSV的病毒滴度下降分别为6.03和4.94 Logs。结论 S/D法和低pH孵放2种处理方法对脂包膜病毒的模拟病毒VSV、Sindbis和PRV病毒,均能有效灭活。

人巨细胞病毒中和抗体快速微量检测方法的建立及应用

目的建立具有较好试验重复性的人巨细胞病毒中和抗体快速微量检测方法。方法建立快速微量中和试验方法,用于健康人血浆及IVIG中的CMV中和抗体效价检测。结果用该方法检测336份健康人血浆,其中CMV中和抗体效价≥1∶128的比例为28.1%;检测27批"蓉生静丙"和9批国内其它厂家IVIG的CMV中和抗体效价,其CMV中和抗体效价的GMTs分别为1∶498和1∶485。结论建立了快速、简便、检测通量高、重复性较好的快速微量中和试验方法,为CMV-IVIG的研制提供了可供选择的血浆筛选方法。

转基因植物疫苗

生产疫苗抗原的植物表达系统以其经济易操作而极具吸引力。本文就转基因植物疫苗的优点、临床研究和应用前景进行简要综述。

静注巨细胞病毒人免疫球蛋白生产工艺中人巨细胞病毒灭活/去除效果研究

目的开展静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(CMV-IVIG)生产工艺中的人巨细胞病毒(HCMV)灭活/去除效果研究,以考察制品的人巨细胞病毒安全性。方法选用HCMV及与其有相似特性的疱疹病毒伪狂犬病毒(PRV)作为指示病毒,考察CMV-IVIG生产工艺的低pH孵放[pH 3.8—4.4,21 d,(24±1)℃]和纳米膜过滤步骤对该类病毒的灭活/去除能力。结果低pH孵放对HCMV的灭活效果虽然<4.00 Log,但盲传三代,没有病毒检出;对PRV的灭活效果在4.00 Log以上。纳米膜过滤步骤在CMV-IVIG加入HCMV后便未检出病毒,且可去除PRV 4.00 Log以上。结论本次研究表明,CMV-IVIG生产工艺中的病毒灭活/去除工艺能有效去除HCMV,保障制品的安全性。

QPCR检测人细小病毒B19方法的建立及其在病毒去除工艺验证中的应用

目的建立1种检测人细小病毒(B19)的荧光定量PCR方法,并应用于纳米膜过滤去除病毒的工艺验证,评价在血液制品生产过程中纳米膜过滤去除B19的效果。方法用上游引物(P1)5’-GGC ACC TCT CAA AAC ACT-3’和下游引物(P2)5’-C CAC TCC TTG CTG ATA CTC-3’,在95℃3min、95℃10s52℃10 s72℃10S条件下扩增40个循环,建立检测B19的QPCR方法并验证该方法的专一性、重复性和灵敏性;最后用该方法检测纳米膜过滤去除制品中B19的效果。结果该方法实验内和实验间的精密度均<5%,最低检测限为50 copies/μL;经检测纳米膜过滤可使样品中B19滴度下降3.8Logs。结论成功建立了具有良好专一性、重复性和灵敏性的荧光定量PCR方法。

重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

目的建立检测重组麻疹病毒载体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗病毒滴度的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用。方法以重组质粒pUC57-S351为模板,扩增SARS-CoV-2 S基因,优化引物浓度,建立qPCR检测方法。对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限。应用建立的qPCR法对生物反应器连续培养感染后1~12 d的重组病毒S基因拷贝数进行检测。结果选择引物浓度为0.20μmol/L建立qPCR方法。该方法能特异性检测SARS-CoV-2 S基因拷贝数;模板浓度在2×10^(2)~2×10^(8)copies/μL之间,线性关系良好(R^(2)=0.995),检测下限为2×10^(2)copies/μL;6次重复检测重组病毒S基因拷贝数的变异系数(coefficient of variation,CV)为2.64%。应用建立的qPCR法检测生物反应器连续培养感染后1~12 d的重组病毒S基因拷贝数的结果与细胞病变法检测结果基本一致。结论建立的qPCR法专属性和重复性良好,可用于重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度检测。

荧光定量RT-PCR检测脑心肌炎病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank中公布的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus EMCV)3D基因保守区段设计并合成1对引物,以提取的EMCV核酸为模板,分别进行荧光定量RT-PCR扩增,优化反应体系及条件,建立脑心肌炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并初步运用于静注人免疫球蛋白(IVIG)纳米膜过滤工艺去除EMCV效果的验证.结果显示该方法实验内和实验间的精密度均小于5%,最低检测限为102copies/μL;纳米膜过滤工艺可使样品中的EMCV滴度下降4Logs.

一种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法的建立

目的建立基于人白血病T细胞株Jurkat的抗人T淋巴细胞免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte immunoglobulin,ALG)淋巴细胞毒效价定量检测方法,并进行验证。方法采用人Jurkat细胞作为靶细胞,抗人T细胞兔免疫球蛋白(商品名:Grafalon)作为待检样品,建立其淋巴细胞毒效价定量检测方法。优化反应体系,考察细胞培养密度、细胞代次对待检样品效价的影响,并对方法的精密度进行验证。结果优化的反应体系组成为50μL待检样品+50μL补体(1∶5稀释)+50μL细胞(5×10^(6)个/mL);细胞传代密度为2×10^(5)个/mL传代培养72 h或3×10^(5)个/mL传代培养48 h用于效价测定最佳;当细胞生长状态较好且一致时,从P10到P25代次的细胞效价测定结果较一致。采用该方法板内重复测定待检样品效价,变异系数(CV)为6.32%,重复性良好;不同代次Jurkat细胞测定待检样品效价6次,CV为4.15%,中间精密度良好。结论建立了一种便捷、精确的测定ALG淋巴细胞毒效价的定量检测方法,为ALG效价测定提供了一种客观、准确的评价手段。

高滴度呼肠孤病毒3型的制备及滴度检测

目的 制备高滴度呼肠孤病毒3型（reovirus 3,Reo-3）病毒液,并检测Reo-3滴度.方法 以幼仓鼠肾细胞（BHK-21）为病毒培养基质和滴度测定细胞.将Reo-3按10^0至10^-5感染复数（MOI）接种BHK-21,再分别用细胞病变法和蚀斑形成法检测病毒,用Karber法计算病毒滴度.结果 BHK-21感染Reo-3后能产生明显病变.以10^-4 MOI的Reo-3接种后48 h,收获液中病毒滴度最高,细胞病变法检测为9.625 lgTCID50/ml,蚀斑形成法检测为8.671 lgPFU/ml.结论 制备了高滴度Reo-3,为开展该病毒去除灭活研究奠定了基础.

静注人免疫球蛋白新生产工艺病毒灭活/去除效果的验证及评估

目的对静注人免疫球蛋白(intravenous human immunoglobulin,IVIG)新生产工艺的病毒灭活/去除效果进行验证及评估。方法选择4种脂包膜病毒[人免疫缺陷综合征病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SV)和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)]及非脂包膜病毒[猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)]作为验证病毒,在缩小的生产规模条件下考察辛酸钠沉淀/深层过滤、低pH孵放和纳米膜过滤步骤对一种或几种指示病毒的灭活/去除能力。结果辛酸钠沉淀/深层过滤步骤可灭活/去除PPV 1.88 Log;低pH孵放对HIV、PRV、SV和VSV的灭活效果最低分别为≥5.22、≥4.26、≥6.56和≥5.69 Log;Bio EX纳米膜可去除PPV达4 Log以上。结论 IVIG新生产工艺的病毒灭活/去除效果合格,可有效灭活/去除未知的、新出现的病原体。

重组人凝血因子Ⅷ病毒灭活/去除工艺验证

目的 验证重组人凝血因子Ⅷ(recombinant human coagulationⅧ,rhFⅧ)病毒灭活/去除工艺。方法 采用S/D法作为rhFⅧ病毒灭活工艺,纳米过滤(20 nm孔径)作为rhFⅧ病毒去除工艺,分析病毒灭活/去除两步工艺对rhFⅧ活性的影响;分别以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、小鼠白血病病毒(xenotropic murine leukemia virus,X-MuLV)及小鼠细小病毒(murine minute virus,MMV)作为指示病毒,对上述工艺进行病毒灭活/去除效果验证。结果 S/D灭活工艺中,3批制品的活性收率分别为96. 2%、100. 4%和103. 2%;(24±2)℃处理180 min后,指示病毒PRV、VSV和X-MuLV滴度降低量(Log10)虽然均<4,但盲传3代,仍未检出病毒。纳米过滤工艺中,3批制品蛋白回收率均大于98%,活性回收率均大于90%,纳米过滤120 min,MMV滴度降低量(Log10)> 4。结论 建立的rhFⅧ病毒灭活/去除工艺,可有效灭活/去除病毒,保证制品的质量和安全。

四川地区供浆员中巨细胞病毒中和抗体效价的分布及体内持续情况

目的分析四川地区供浆员中巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)中和抗体效价分布及体内持续情况。方法建立CMV中和抗体检测方法,检测四川地区8个浆站采集的2 002份健康人血浆中CMV中和抗体水平,并对其中44位供浆员进行1年跟踪检测;对同一供浆员进行4年长期追踪检测。结果四川地区供浆员血浆CMV中和抗体效价主要分布在1∶16～1∶64之间,阳性率(≥1∶8)高达98.35%,其中效价≥1∶192的占8.04%;44名供浆员CMV中和抗体水平在1年内保持稳定;一名供浆员在4年内CMV中和抗体效价保持较高水平。结论四川地区供浆员中CMV自然感染率较高,部分供浆员CMV中和抗体水平较高,且在较长的时间内保持稳定,本研究为CMV特异性人免疫球蛋白的研制提供了依据。

狂犬病人免疫球蛋白低pH孵放工艺的病毒灭活验证

目的对狂犬病人免疫球蛋白(human rabies immunoglobulin)低pH孵放生产工艺[pH 3.8~4.4,(24±1)℃,21 d]进行脂包膜病毒灭活验证。方法以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、辛德毕斯病毒(sindbis virus,SV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)作为研究病毒,考察低pH孵放对这些脂包膜病毒的灭活能力。同时考察低pH孵放步骤对制品质量的影响。结果在工艺设定的参数范围内,低pH孵放后4种脂包膜病毒的滴度降低均在4.00 Log以上,且3批狂犬病人免疫球蛋白的纯度和分子大小分布保持稳定,抗体效价与灭活前差异均在方法允许的波动范围内。结论低pH孵放工艺能有效地灭活脂包膜病毒,保证了狂犬病人免疫球蛋白制品的质量及安全性。

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法 根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果 优化后的荧光定量PCR反应体系：Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件：95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好（R2=0.999）,扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）、牛细小病毒（bovine parvovirus,BPV）、鼠细小病毒（minute virus of mice,MVM）及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%～2.81%,试验间CV为1.23%～2.21%,均〈5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论 已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。

人促红细胞生成素基因的优化及其在大肠杆菌中的表达

目的对人促红细胞生成素（human erythropoietin，HuEPO）基因进行优化，提高其在大肠杆菌中的表达量以及纯化过程中的回收率。方法对HuEPO基因的碱基序列进行设计，用大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，构建高效表达重组（r）HuEPO（rHuEPO）的基因。设计rHuEPO的氨基酸突变位点，并对这些位点进行定点诱变，获得高亲水性的突变（M）rHuEPO（MrHuEPO）。对rHuEPO和MrHuEPO的三级结构进行预测及对比．验证突变位点设计的合理性。将rHuEPO和MrHuEPO基因克隆至表达载体pET-15b，并在大肠杆菌中进行表达。对表达产物进行初步纯化和复性，比较复性时的rHuEPO和MrHuEPO可溶性和回收率，并用HuEPO活性检测试剂盒检测rHuEPO和MrHuEPO的活性。结果rHuEPO和MrHuEPO在大肠杆菌中得到成功表达，表达量均〉25％。三级结构预测对比结果表明，突变位点设计合理。rHuEPO和MrHuEPO的表达量无明显差别，但复性时MrHuEPO的可溶性（回收率〉90％）明显高于rHuEPO（回收率〈25％）。rHuEPO和MrHuEPO的比活分别为2.36×10^5和2．33×10^5IU／mg。结论成功构建了可在大肠杆菌中高效表达rHuEPO和MrHuEPO的基因，并通过定点诱变提高了复性时的MrHuEPO可溶性。