重组人抗乙型肝炎病毒表面抗体的筛选及序列分析

目的克隆、筛选人抗乙型肝炎病毒表面抗体(抗-HBs),并对其基因序列进行分析。方法从抗-HBs抗体阳性血液中分离淋巴细胞,提取总RNA,合成cDNA,以此为模板,PCR扩增轻链和重链抗体可变区基因;应用已构建的抗体支架载体,构建重组表达载体,转化毕赤酵母X33,建立相应的酵母表达文库;甲醇诱导表达,Westernblot及ELISA筛选抗-HBs抗体阳性菌株;PCR扩增DNA片段,进行测序及Blastn比对,并与已发表的抗-HBs抗体序列进行同源性分析。结果重链及轻链抗体重组表达载体经双酶切鉴定,证明构建正确;经Westernblot及ELISA筛选,获得了具有HBsAg结合活性的完整轻重链抗体;轻链可变区与已发表序列核苷酸同源性为93%,而氨基酸同源性仅为88%,尤其CDR3变异较大;重链可变区与已发表序列同源性较低,CDR3区基因长度及序列均有较大差别。结论应用毕赤酵母表达体系筛选,获得了新的抗-HBs抗体。

重组人抗乙型肝炎表面抗体表达的研究

目的应用毕赤酵母表达体系,表达、制备人抗乙型肝炎表面抗原全分子抗体。方法以抗-HBs抗体阳性个体为对象构建抗体表达文库,筛选抗-HBs抗体轻链和重链可变区序列,并将其重组至同一表达载体pPICZαIgG,转化X33酵母菌,甲醇诱导表达后进行ELISA筛选鉴定及免疫印迹分析。结果Western印迹检测在分子量约140kD处出现特异性染色条带,ELISA结果表明所获得抗体分子具有良好的乙型肝炎表面抗原结合活性。结论在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生具抗原结合活性的完整分泌型抗-HBs抗体。

应用毕赤酵母分泌表达筛选人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc

目的:利用毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体分泌表达文库获得具特异性狂犬病毒抗原结合活性的分泌型小分子抗体(scFv-Fc)。方法:RT-PCR方法扩增获得一组轻链和重链可变区基因。利用重叠延伸PCR方法组装scFv基因后克隆入毕赤酵母scFv-Fc抗体库通用表达质粒pPICZα/Fc后,电转化X33酵母菌,甲醇诱导表达后进行ELISA筛选、基因序列分析及免疫印迹分析。结果:构建了抗狂犬病毒毕赤酵母分泌型scFv-Fc库,获得了12株阳性菌株。对其中2株阳性克隆进行了序列分析证实为新的抗体可变区基因。ELISA、Western blotting分析,证实该scFv-Fc具有特异性狂犬病毒抗原结合活性,相对分子质量为56 000。结论:通过毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc分泌表达文库筛选获得具较高亲和力的新scFv-Fc抗体。

人参皂苷Rh3对人结肠癌细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨人参皂苷Rh3对人结肠癌细胞SW480增殖与凋亡的影响。方法体外培养的人结肠癌细胞SW480分别用无血清培养液稀释的终浓度为15、30、60、120和240μg/ml的人参皂苷Rh3作用24、48及72h,应用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞增殖;采用终浓度为15μg/ml的人参皂甙Rh3作用于SW480细胞24及72h,应用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡,采用终浓度为15、20μg/ml的人参皂甙Rh3作用于SW480细胞24及72h;应用丫啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染法计算细胞凋亡率和坏死率。结果 15μg/ml人参皂苷Rh3作用48h即可明显抑制SW480细胞增殖,其作用随剂量增加和作用时间延长而增强,30μg/ml人参皂苷Rh3作用72h抑制率超过80%;15μg/ml人参皂苷Rh3作用24h部分细胞凋亡,胞浆呈棕色,作用72h凋亡细胞增多;15μg/ml人参皂苷Rh3作用24h细胞凋亡率为25.5%,20μg/ml人参皂苷Rh3作用24h细胞凋亡率为31%,未见细胞坏死,15μg/ml人参皂苷Rh3作用72h细胞凋亡率为55%、坏死率为7%,20μg/ml人参皂苷Rh3作用72h细胞凋亡率为67.5%、坏死率为7%。结论人参皂苷Rh3能抑制人结肠癌细胞SW480增殖,诱导其凋亡,作用呈剂量依赖性和时间依赖性。

人热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的在毕赤酵母(pichiapastoris)中高效表达人热休克蛋白70(hHSP70),制备具有天然与hHSP70相同结构和活性的重组hHSP70(rhHSP70)。方法用PCR法自人DNA文库中克隆hHSP70的DNA,构建真核表达载体pPICZα/hHSP70。经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X33。用PCR法筛选Zeocin抗性的转染阳性克隆,Westernblot法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的rhHSP70,筛选高表达工程菌。结果经PCR法克隆的hHSP70DNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hHSP70DNA定向插入pPICZα,构建pPICZα/hHSP70真核表达载体并经电转化获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDSPAGE和Westernblot分析显示了甲醇诱导的培养基上清中含有rhHSP70,分子量72kD。氨基酸序列分析证实rhHSP70氨基端15个氨基酸与天然rhHSP70完全一致。rhHSP70表达量高达250mg·L-1。结论获得高效表达rhHSP70的毕赤酵母工程菌。

人抗狂犬病毒抗体在毕赤酵母中的分泌表达

目的经分步整合法在巴氏毕赤酵母中表达人抗狂犬病毒全分子抗体。方法分别构建人重链和轻链抗体表达质粒,以分步整合法电转化X33酵母菌,甲醇诱导表达后进行ELISA筛选及Western blot分析。结果SDS-PAGE、Western blot检测均在分子量约55kD及25kD处出现特异性条带,ELISA检测显示所获全分子抗体具有良好的狂犬病毒抗原结合活性,表达量约8～10mg/L。结论在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生具狂犬病毒抗原结合活性的分泌型人全分子抗体。

新生大鼠脊髓源性神经干细胞的分离培养及分化鉴定

目的:探讨分离、培养新生大鼠脊髓源性神经干细胞的方法并对其进行分化鉴定,为临床应用脊髓神经干细胞进行周围神经系统疾病的替代治疗奠定细胞学基础。方法:首次采用注射器灌注法分离新生24hWistar大鼠脊髓源性神经干细胞,神经细胞培养液调节细胞终浓度并进行培养,形成克隆后,传代。将传至第1代培养细胞加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导其分化。形态学方法观察细胞的生长状态,利用鼠抗Nestin抗体、鼠抗GFAP抗体、鼠抗MAP-2抗体进行分化的神经干细胞免疫组织化学鉴定。结果:新生大鼠脊髓源性神经干细胞可在体外培养条件下贴壁生长,在血清的作用下可分化为具有典型神经细胞形态、表达特异性组织蛋白Nestin、GFAP、MAP-2的神经细胞。结论:大鼠脊髓内可分离出脊髓源性神经干细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力。

前列腺酸性磷酸酶在非前列腺腺癌中的表达

目的:探讨前列腺相关抗原-前列腺酸性磷酸酶(PAP)在非前列腺癌中的表达水平.方法:分别用RT-PCR方法和Western Blot方法检测多种腺癌细胞系中PAP mRNA和PAP蛋白的表达水平;用免疫组织化学方法检测多种腺癌肿瘤组织中的PAP蛋白的表达水平.结果:3种结肠癌细胞(colo201,colo205和colo320)、3种胃癌细胞(MKN-7,MKN-28和MKN-45)和7种乳腺癌细胞(OCUB-F,OCUB-M,R-27,MCF-7,CRL-1500,YMB-1-E和MDA-MB-231)表达PAP mRNA和PAP蛋白,结肠癌、胃癌和乳腺癌肿瘤组织中PAP呈阳性表达.在检测的5种肾细胞癌细胞和肾细胞癌组织中均未发现有PAP的表达.结论:PAP是结肠癌、胃癌和乳腺癌的新靶点.

犬原位回肠构建全尿道、膀胱的实验方法特征

目的:探索犬膀胱全切后以回肠构建全尿道、膀胱术的实验方法。方法:实验于2004-12/2005-07在吉林大学药学院生物工程研究室完成。体质量13kg的雄性京犬12只,术前禁食24h,以30g/L戊巴比妥钠按1mL/kg剂量对犬麻醉。取腹部正中切口,切除膀胱及尿道。在距回盲部约10cm处取一段30cm带血供的回肠袢,恢复肠道的连续性。取25cm回肠沿着肠管系膜的对侧缘纵向剖开,将剖开的肠管对折缝合成袋状,并将两侧输尿管种植于回肠新膀胱的适当位置。取5cm回肠剥离黏膜层并缝制成管状,构建尿道,在回肠新膀胱的底部戳孔与其缝合。连接在膀胱及尿道的原位,术中静点氧氟沙星100mL(含氧氟沙星0.2g/L)、葡萄糖注射液250mL、生理盐水250mL、缝合术后刀口,并静点氧氟沙星0.2g/d,连续给药7d,1周后正常进食、继续饲养1个月,观察动物排尿情况,行X射线影像学检查。结果:9只犬进入结果分析,另3只由于麻醉过度死亡。术后1个月观察实验动物犬,进食正常,排尿正常。术后4周X射线造影检查显示:贮尿囊显影良好,无梗阻;回肠替代膀胱充盈,肠黏膜替代尿道再生状况良好。结论:建立的犬膀胱全切原位回肠代膀胱、尿道术的实验方法,可做为组织工程膀胱、尿道移植研究的模型。

键合表柔比星纳米胶束对Walker-256细胞株的增殖抑制作用

目的考察聚乳酸碳酸酯键合表柔比星纳米胶束(EPI-NPs)在体外的释药特点及对Walker-256肿瘤细胞株的增殖抑制作用。方法应用透析法制备化学键合的EPI-NPs,并用动态激光光散射(DLS)测定其粒径,扫描电镜观察其形态,绘制药物体外释放曲线,通过MTT法测定和比较EPI-NPs与表柔比星(EPI)对Walker-256细胞株的增殖抑制作用,并用激光共聚焦显微镜检测Walker-256细胞对纳米胶束的摄取情况。结果键合药具有良好的缓释性,释放率随pH值降低而提高;与游离EPI相比较,键合药对Walker-256细胞株增殖的抑制更明显,随药物作用时间和浓度的增大,抑制率逐渐增高。结论利用酸降解腙键合成的EPI-NPs具有良好的细胞内缓释性和细胞毒性。

黏蛋白质手性合成多肽疫苗对BALB/c小鼠CTL的诱导作用

目的 :研究由具有局部手性特征的合成多肽D MUC1和小鼠血清白蛋白 (mouseserumalbumin ,MSA)构成的多肽疫苗对小鼠MUC1特异性CTL的诱导作用 .方法 :用固相合成法合成含有D Ser的多肽D MUC1 ,纯化后与载体蛋白MSA偶联 ,分别以细胞因子重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)和胸腺肽 (TP)为佐剂 ,免疫BALB/c小鼠 ,测定淋巴细胞增殖活性、MUC1特异性CTL杀伤活性 .结果 :合成肽经HPLC纯化后 ,质谱分析证明目的肽的分子量与理论值相符 ;D MUC1多肽疫苗对BALB/c小鼠淋巴细胞增殖有明显的促进作用 ;D MUC1多肽疫苗诱导出的特异性CTL杀伤MUC1阳性肿瘤细胞GZ .A5 .3H .4 .结论 :研究结果表明D MUC1合成肽疫苗可以在小鼠体内诱导出MUC1特异性CTL 。

溶组织梭菌胶原酶的提取及活性分析

目的 分离获得高产量、高比活性的胶原酶。方法 以溶组织梭菌作为菌种 ,确立最佳培养条件 ;应用胶原悬浮分析法测定胶原酶总活性 ;应用FALGPA胶原酶活性测量法进行比活性分析。结果 获得了高产量、高比活性的胶原酶。结论 通过改良并优化溶组织梭菌培养条件 ,可以获得低成本、高产量、高活性的胶原酶。

乳腺癌HER2／neu手性多肽疫苗的实验研究

目的研究具有局部手性的HER-2/neu多肽疫苗对细胞毒性T细胞(CTLs)的诱导作用。方法用固相法合成HER-2/neu手性肽疫苗并进行纯化,建立小鼠的乳腺癌模型,用上述手性肽做疫苗、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)为佐剂,对小鼠进行免疫,分别应用MTT法、ELISPOT法、颗粒酶释放法测定T细胞的增殖,T细胞分泌IFN-γ,CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。结果合成的手性HER-2/neu可明显的促进T细胞增殖,促进T细胞分泌IFN-γ及诱导CTL杀伤乳腺癌细胞。结论手性HER-2/neu多肽疫苗可在小鼠体内诱导特异细胞免疫,增加对乳腺癌细胞的杀伤作用。

rhHSP70-HER2/neu抗原肽对小鼠乳腺癌的治疗作用研究

目的:使用在毕赤酵母中重组表达的rhHSP70与合成的HER2/neu抗原肽在特定条件下形成复合物,探讨其用于肿瘤生物治疗的可行性。方法:在ADP存在的条件下,将rhHSP70与合成的HER2/neu抗原肽体外非共价结合形成复合物,并分次免疫BALB/c小鼠,检测该复合物诱导特异性CTL的能力和对小鼠乳腺癌的治疗作用。结果:rhHSP70-HER2/neu抗原肽复合物免疫小鼠后,可以诱导出肿瘤特异性CTL,并对小鼠的乳腺癌有明显的治疗作用。结论:在毕赤酵母中重组表达的rhHSP70可以在体外与一定的抗原肽非共价结合形成复合物,该复合物具有较强的诱导特异性CTL的能力。

前列腺特异性抗原体外诱导结肠癌特异性CTLs

目的检测前列腺特异性抗原(PSA)在结肠癌中的表达水平,探讨PSA作为结肠癌主动免疫治疗新靶点的可能性。方法用RT-PCR方法检测结肠癌细胞系中PSAmRNA的表达水平;免疫组织化学方法检测结肠癌细胞中PSA蛋白的表达水平。利用PAP表位肽对结肠癌患者的PBMCs进行体外诱导,ELISA法检测PSA特异性IFN-γ分泌水平;51Cr释放法检测PSA多肽特异性CTLs对结肠癌细胞的细胞毒性。结果4种结肠癌细胞(colo201,colo205,SW480和SW620)表达PSA mRNA和PSA蛋白。HLA-A+24结肠癌患者的PBMCs经体外诱导产生的CTLs可特异性杀伤HLA-A24+/PSA+的结肠癌细胞,CTLs的细胞毒活性依赖于CD8+的T淋巴细胞。结论结肠癌患者的外周血中存在PSA特异性CTLs前体细胞,PSA有可能成为结肠癌特异性免疫治疗的靶点。

TRAIL与DDP联合诱导急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的实验研究

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与顺铂(DDP)联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞的抑制作用,为白血病的临床治疗提供新思路。方法构建重组载体pACCMV-TRAIL,用脂质体法进行细胞转染,MTT法检测单独或联用TRAIL及DDP处理的各组肿瘤细胞的增殖变化,FCM技术检测细胞凋亡变化。结果DDP组、TRAIL转染组及联合用药组细胞增殖抑制率均高于空白对照组(均P<0.05),且联合用药组高于单独用药组(P<0.05);FCM示凋亡率也明显增高。结论TRAIL和DDP联用可抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖,具有协调作用。

TRAIL与DDP联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞增殖作用的影响

目的探讨肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)与顺铂(DDP)联合应用抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖的可能机制。方法以重组载体pACCMV-TRAIL转染人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat,Western印迹检测细胞中TRAIL蛋白表达情况,以及单独或联合应用TRAIL及DDP处理的各组白血病细胞中,凋亡相关蛋白caspase-3、NF-κB和survivin表达水平的变化。结果DDP组及联合用药组明显抑制了survivin蛋白的表达,DDP组、TRAIL转染组及联合用药组细胞caspase-3表达上调,核因子(NF)-κB表达下降,且联合用药组作用强于单独用药组。结论TRAIL和DDP可通过caspase、NF-κB途径抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖,同时DDP通过对survivin的调节发挥对TRAIL的协同作用。

兔膀胱移行上皮细胞的体外培养

目的:对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,探索用于泌尿系统组织工程的膀胱移行上皮种子细胞的最佳培养方法。方法:实验于2005-09/2006-01在吉林大学药学院生物工程实验室完成。①取1月龄新西兰大耳白兔,耳缘静脉行空气栓塞处死,超净台内无菌取膀胱。②采用中性蛋白酶分离膀胱各层组织。③胰蛋白酶消化获得膀胱移行上皮细胞。④将获取的膀胱移行上皮细胞分别接种到含体积分数为0.01,0.05,0.1血清的DMEM-F12培养液进行培养。④每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况;分别在第1,3,5,7,9天以四甲基偶氮唑盐法作细胞生长曲线。结果:①原代移行上皮细胞于接种后34～48h贴壁,培养六七天时可达80%融合,呈典型铺路石状。②传代后的细胞生长稳定快速,24～36h贴壁,五六天可达80%融合。③应用四甲基偶氮唑盐法检测不同体积分数血清对移行上皮细胞增殖的影响,显示膀胱移行上皮细胞在含有体积分数为0.05血清的DMEM-F12培养中生长状态最佳。结论:采用中性蛋白酶与胰蛋白酶联合消化法,对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,是一种稳定、快速的膀胱移行上皮细胞的培养方法。

UPLC-Q-TOFMS^E技术结合UNIFI数据库快速分析桑黄化学成分

首次采用UPLC-Q-TOFMS^E技术结合UNIFI数据库筛查方法对桑黄中的化学成分进行快速鉴定。本实验共鉴定出58个化合物,包括11个有机酸及有机酸酯、7个苯丙素类、7个甾体、6个三萜、5个黄酮、5个酚类、4个二萜及其他化合物。该方法可对桑黄中的化学成分进行全面、快速地分析,为桑黄的质量控制和药效物质基础的阐明提供参考。

人源抗体筛选和表达载体的构建

目的:构建一个可供抗体CDR(决定簇互补区)进行自由替换、筛选、表达的通用载体,并对其生物学功能进行鉴定。方法:在已构建好的具有Fc段的完全人源抗狂犬病病毒抗体表达载体基础上,利用PCR介导的定点突变技术,引入2个可供CDR3区进行自由替换的限制性酶切位点,构建出通用表达载体。体外合成人源、鼠源抗乳腺癌Her2抗体的CDR3区,克隆至已构建的通用载体,在毕赤酵母中诱导表达。应用ELISA和Western Blotting技术对亲本抗体和新抗体进行生物学及免疫学分析。结果:PCR、Western Blotting等试验表明具有Her2抗原结合活性的人源和鼠源突变型抗体获得成功表达,通过对表达产物的免疫学及功能学检测证明所表达出的抗体具有抗原中和活性,而且鼠源抗体的活性要稍高于人源抗体。结论:成功构建了可用于功能性抗体筛选和表达的通用载体,对抗体的体外亲和力成熟及抗体的人源化有重要意义。