基于线粒体能量代谢途径探讨资癸益冲方改善早发性卵巢功能不全小鼠卵巢功能的作用机制

目的:探讨资癸益冲方通过线粒体能量代谢途径改善早发性卵巢功能不全(POI)模型小鼠卵巢功能的作用与机制。方法:80只SPF级雌性C57BL/6N小鼠随机分为正常组、模型组、西药(辅酶Q10)组和中药(资癸益冲方)组,每组20只。除正常组外,腹腔注射环磷酰胺(CTX)建立POI模型小鼠,造模成功后,各组灌胃给予相应药物。HE染色观察卵巢组织形态学,放射免疫法检测血清雌二醇(E_2)、卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)水平,透射电镜观察卵巢颗粒细胞线粒体结构,比色法测定颗粒细胞三磷酸腺苷(ATP)含量,免疫组化法和Western Blot法检测与线粒体能量相关的过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)和线粒体转录因子A(TFAM)蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠卵巢各级卵泡颗粒细胞层数减少,闭锁卵泡增多,E_2水平下降(P<0.05),FSH、LH水平升高(P<0.01),颗粒细胞线粒体数量减少,出现嵴断裂及空泡化改变,外膜不完整,ATP含量下降(P<0.05),PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表达下降(P<0.01);与模型组比较,中药组小鼠卵巢各级卵泡颗粒细胞层数增多,闭锁卵泡减少,E_2水平升高(P<0.01),FSH、LH水平下降(P<0.01),颗粒细胞线粒体结构改善,ATP含量升高(P<0.05),PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论:资癸益冲方可以改善线粒体能量代谢减少卵巢颗粒细胞的凋亡保护POI模型小鼠卵巢功能,其机制可能与激活PGC-1α/NRF1/TFAM信号通路有关。

寿胎丸对复发性流产小鼠胚胎滋养细胞上皮间质转化的影响

目的 探讨寿胎丸对复发性流产(RSA)小鼠胚胎滋养细胞上皮间质转化(EMT)及胚胎丢失率的影响。方法 将90只6~8周龄CBA/J雌性小鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、地屈孕酮组和寿胎丸低、中、高剂量组,每组15只;正常组与BALB/c雄鼠合笼建立正常妊娠小鼠,其他组雌鼠与DBA/2雄鼠合笼建立RSA小鼠模型。合笼前14 d开始每日给药,寿胎丸低、中、高剂量组分别以寿胎丸7.58、15.17、30.33 g/kg灌胃,地屈孕酮组以地屈孕酮0.003 g/kg灌胃,正常组和模型组以等体积蒸馏水灌胃。连续给药至妊娠第6天(PD 6),各组随意选取9只孕鼠麻醉处死后剥离胚胎,HE染色观察PD 6小鼠母胎界面滋养细胞病理形态学改变;免疫荧光染色、实时荧光定量PCR检测各组胚胎滋养细胞EMT标志物上皮钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及β-连环蛋白(β-catenin)的蛋白及mRNA表达。各组其余孕鼠继续给药至妊娠第14天(PD 14),麻醉处死后观察胚胎丢失情况。结果 与正常组比较,模型组孕鼠胚胎滋养细胞中上皮细胞标记物E-cadherin蛋白及mRNA表达升高(P<0.05),间质细胞标志物Vimentin蛋白及mRNA表达下降(P<0.05)、β-catenin蛋白及mRNA表达下降(P<0.05),胚胎丢失率升高(P<0.05);与模型组比较,各剂量寿胎丸组及地屈孕酮组胚胎滋养细胞中E-cadherin蛋白及mRNA表达下调(P<0.05),Vimentin蛋白及mRNA表达升高、β-catenin蛋白及mRNA表达升高(P<0.05),其中寿胎丸中、高剂量组及地屈孕酮组更为明显,寿胎丸低剂量组胚胎丢失率有所降低(P>0.05),寿胎丸中、高剂量组及地屈孕酮组胚胎丢失率下降(P<0.05)。结论 寿胎丸能降低RSA小鼠胚胎丢失率,其机制可能是通过激活滋养细胞内β-catenin信号分子,促进EMT改善胚胎滋养细胞迁移侵袭能力,以利于胚胎在宫腔内着床而发挥保胎作用。

基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究补肾法对体外培养小鼠卵母细胞成熟的促进作用

目的研究补肾法对体外培养小鼠卵母细胞成熟的促进作用及其与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路的关系。方法给6~8周龄雌性大鼠灌服补肾调经Ⅲ号方制备含药血清。将3~4周龄雌性小鼠随机分为A、B组,A组灌胃蒸馏水,B组序贯灌胃补肾调经系列方(Ⅱ号方和Ⅲ号方),各灌胃12 d。第11天腹腔注射孕马血清促性腺激素(5 IU/只),48 h后剥离卵巢,取出卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。将A组COCs分为空白对照组和抑制剂组(25μmol/L LY294002),B组分为补肾组(10%补肾调经Ⅲ号方含药血清)和补肾加抑制剂组(10%补肾调经Ⅲ号方含药血清+25μmol/L LY294002)。体外培养18 h后,在显微镜下统计各组第一极体排出量并计算排出率。收集COCs, RT-PCR法检测各组COCs中Bcl-2、Bax、PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达,免疫荧光染色法检测各组COCs中Bcl-2、Bax、PI3K、AKT、mTOR、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白表达。结果第一极体排出率补肾组高于空白对照组(P<0.05),抑制剂组低于空白对照组(P<0.05),补肾加抑制剂组低于补肾组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,与空白对照组比较,补肾组COCs中Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均升高(P<0.05),Bax mRNA表达降低(P<0.05);抑制剂组COCs中Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均下降(P<0.05),Bax mRNA表达升高(P<0.05)。与补肾组比较,补肾加抑制剂组COCs中Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均降低(P<0.05),Bax mRNA表达升高(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,各组间PI3K、AKT、mTOR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,补肾组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT升高(P<0.05),Bax蛋白表达降低(P<0.05);抑制剂组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.05)。与补肾组比较,补肾加抑制剂组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.05)。结论补肾调经系列方可通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路、上调Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表达的比值、抑制COCs凋亡从而促进小鼠卵母细胞成熟。