体内靶向树突状细胞的腺病毒通用肿瘤疫苗的构建

目的采用细胞菌内同源重组法构建人端粒酶逆转录酶(hTRT)重组腺病毒,并将其以甘露聚糖进行表面修饰,以探索构建一种新型的体内靶向树突状细胞(DC)的通用型肿瘤抗原。方法将编码hTRT的cDNA序列自pBABE-PURO-hTERT质粒亚克隆至腺病毒质粒pAdTrack-CMV中,将后者与骨架质粒pAdEasy-1经电冲击共转化宿主菌BJ5183进行同源重组。经过克隆筛选获得正确的重组腺病毒质粒后,将其线性化转染293细胞包装获得重组腺病毒。将重组腺病毒扩增纯化,以甘露聚糖进行表面修饰。最后将甘露聚糖修饰后的腺病毒免疫小鼠。结果重组腺病毒能在293细胞产生细胞病变效应(CPE),腺病毒转染后的细胞通过PCR及免疫印迹能测到hTRT的表达。重组腺病毒经过甘露聚糖修饰后,经高碘酸席碱染色呈阳性。重组腺病毒能在小鼠体内靶向脾脏DC细胞。结论成功构建能体内靶向DC细胞的hTRT重组腺病毒,为通用型肿瘤疫苗的研发作出了新的探索。

鸡Tie-2受体胞外片段的原核表达及目的蛋白免疫原性的研究

目的 研究鸡 Tie- 2受体胞外片段 (配体结合域 )的原核表达以及目的蛋白对小鼠的抗原性。方法 用 PCR方法从既往构建的包含鸡 Tie- 2受体胞外段基因的表达质粒扩增目的片段 ,进而构建 PQE原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达 ,将目的蛋白进一步纯化、复性并免疫小鼠 ,获得抗血清 ,用 EL ISA和 Western blotting检测抗血清中抗体的存在。结果 经酶切分析及测序鉴定表明获得了鸡 Tie- 2受体胞外目的片段的 PQE原核表达载体 ,能高效表达目的蛋白 ,将其免疫小鼠可产生抗重组蛋白的抗体。结论 用原核表达的方式可成功的获得鸡Tie- 2受体胞外目的片段的蛋白 。

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达。方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质。结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,West-ern Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白。结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础。

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的构建小鼠白细胞介素-5(IL-5)基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况。方法以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3·1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mIL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用WesternBlot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mIL-5,Westernblot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。结论成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础。

肌钙蛋白的克隆表达及对卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:研究肌钙蛋白（Troponin,TnI）对卵巢癌的治疗作用。方法:将TnI构建于原核表达载体PTrc99A并转化到大肠杆菌JM109中。细胞在LB培养基中培养到对数生长期后,加IPTG至终浓度为5mmol/L诱导。离心收集菌体,超声破菌。包涵体纯化并复性后在体内、体外抑制血管生成,并用于治疗荷有卵巢癌SKOV3的裸鼠,肿瘤体积每周测2次。结果:TnI能在体内和体外抑制血管生成。TnI治疗组肿瘤生长明显受到抑制,生存率升高。结论:TnI可抑制荷瘤小鼠的卵巢癌生长,延长其生存率。

异种基质金属蛋白酶-2肿瘤细胞疫苗的制备与功能研究

目的 构建异种基质金属蛋白酶 - 2 (matrix m etalloproteinase- 2 ,MMP- 2 )肿瘤细胞疫苗 ,初步探讨疫苗的功能。方法 将鸡 MMP- 2转染到 CT2 6细胞内制成肿瘤细胞疫苗 ,用 MTT〔四甲基偶氮唑盐 ,3- (4 ,5 -dimetylthiazol- 2 - yl) - 2 ,5 - diphenyltetrazolium brom ide〕比色法检测转染后的细胞活性 ,在小鼠体内做疫苗的致瘤性实验和保护性实验。结果 用 RT- PCR挑选出 MMP- 2表达量最高的细胞株作为研究对象。通过 MTT比色法发现转染虽然增加了肿瘤细胞内 MMP- 2的表达 ,但是并没有改变肿瘤细胞的生长趋势。经过致瘤性实验和保护性实验 ,还初步发现疫苗可以起到抑制肿瘤生长和延长动物生存时间的作用。结论 异种基质金属蛋白酶 - 2肿瘤细胞疫苗构建成功 ,并且具有抗肿瘤的作用。

重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤实验研究

目的肿瘤生长具有血管依赖性。内皮抑素为胶原X羧基末端裂解片段,是重要的内源性血管抑制因子。实验中利用重组人内皮抑素腺病毒(recombinanthumanendostatinadenorirus,Ad-hEndo)在肿瘤局部给药以探索其抗血管基因治疗的可行性。方法以Ad-hEndo感染体外培养肿瘤细胞,观察重组蛋白表达及其对培养的血管内皮细胞的抑制效应;在裸鼠A549肺癌模型中瘤内注射重组病毒,观察肿瘤抑制效应、剂量依从效应和毒副反应。结果不同感染复数的Ad-hEndo感染肿瘤细胞均表达重组内皮抑素蛋白,并能抑制血管内皮细胞的生长。动物实验中Ad-hEndo治疗组肿瘤体积及肺转移结节数明显低于对照组,且转移数与治疗剂量负相关。结论以腺病毒为载体的肿瘤局部血管基因治疗能抑制肿瘤新生血管形成进而有效抑制肿瘤生长和转移,其效应具有剂量依从性。